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盐芥钠磷转运体基因在转基因烟草中的功能鉴定

2020-12-01阅读(425)

盐芥钠磷转运体基因在转基因烟草中的功能鉴定

论文摘要

磷是植物生长和发育不可缺少的大量营养元素之一,是植物体内重要的组成元素,同时又以多种方式参与植物体内的各种生理生化过程。因此,植物对磷元素的吸收以及磷元素在植物体内的代谢成为植物科学研究的重点课题之一。本实验室从盐生植物盐芥中克隆出一个Na+/pi转运体基因,并在酵母突变体中进行了功能验证和编码产物磷转运活性的研究,确定了该基因编码的转运体是一种高亲和Pi转运体,其Km分别为7.4μM（pH=6.0）和8.7μM（pH=7.5）。该基因主要在盐芥的叶中进行表达,通过GFP融合蛋白将该蛋白定位于叶绿体上。在高等植物中,有关Na+/Pi转运体基因的克隆及功能鉴定鲜有报道,其生物学功能有待研究。本工作通过PCR技术获得了盐芥Na+/Pi转运体基因全长序列,经分析发现该基因含有8个内含子、9个外显子,编码一条多肽。对盐芥基因组进行Southernblotting分析,发现Na+/pi转运体基因为单拷贝基因。将基因切除N-端信号肽编码序列后与gfp融合,转入酵母中进行表达并检测荧光信号,发现融合基因产物定位于酵母细胞膜上,为该基因能够成功修复酵母突变体的磷转运功能提供了细胞学证据。将Na+/pi转运体基因转入烟草,PCR检测和Southern杂交结果表明,该基因已成功整合到转基因烟草的基因组中。采用实时荧光定量RT-PCR分析转基因烟草中Na+/pi转运体基因的表达强度,以烟草内源actin的表达强度为参照,结果表明Na+/pi转运体基因在转基因植株中有较高强度的表达。从转基因烟草植物分离叶绿体,测定Na+/Pi转运体蛋白的磷转运活性,结果表明转基因植株的磷转运活性与对照植株相比提高了10%-20%,不同株系的磷转运活性提高幅度有差异。在低磷培养基上,转基因烟草比对照烟草生长快,小苗根系较长,叶片数多于同期的对照植株,表明该基因在磷胁迫环境中有助于植物对磷的利用和维持较高的生长速率。利用溶液培养的方法研究低磷条件下不同烟草植株的生理变化,发现在低磷处理14天后,转基因植株的根冠比明显高于对照植株的。光合作用测定结果表明转基因烟草的光合速率比对照植株有提高。Na+/Pi转运体蛋白定位于叶绿体,低磷条件下转基因植株离体叶绿体表现出提高的磷转运活性可能直接或间接影响光合速率,从而增加细胞磷效率。这些结果表明过表达Na+/Pi转运体蛋白可以提高植物对低磷环境的适应性。本工作还根据Na+/Pi转运体基因序列设计并构建出RNAi干扰体,并用以转化拟南芥和盐芥,为深入了解该基因的生物学功能完成了部分基础工作。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 符号说明
  • 第一部分 前言
  • 1.1 植物细胞中磷的存在形式
  • 1.2 磷是作物生长的重要限制因素
  • 1.3 植物对低磷胁迫环境的适应性机理
  • 1.3.1 形态学的变化
  • 1.3.2 生理生化上的变化
  • 1.3.3 分子水平上的变化
  • 1.4 本工作目的和意义
  • 第二部分 材料与方法
  • 2.1 材料
  • +/Pi转运体基因的Southern blot分析'>2.2 盐芥Na+/Pi转运体基因的Southern blot分析
  • 2.2.1 盐芥基因组DNA的提取
  • 2.2.2 Southern blot分析
  • 2.3 盐芥基因全长序列的获得
  • +/Pi转运体在酵母中的定位'>2.4 Na+/Pi转运体在酵母中的定位
  • 2.4.1 酵母遗传转化所用溶液和培养基
  • 2.4.2 酵母转化方法
  • 2.5 质粒的重组和转化
  • 2.5.1 质粒载体及培养基
  • 2.5.2 质粒DNA的制备和纯化
  • 2.5.3 质粒DNA的限制性酶切
  • 2.5.4 DNA片段的去磷酸化
  • 2.5.5 DNA片段的回收和定量
  • 2.5.6 外源DNA片段与质粒载体的连接
  • 2.5.7 大肠杆菌感受态的制备和转化
  • 2.5.8 重组质粒的鉴定
  • 2.6 农杆菌介导的烟草遗传转化
  • 2.6.1 重组质粒转入农杆菌
  • 2.6.2 农杆菌介导的烟草遗传转化
  • 2.7 转化植株的分子检测
  • 2.7.1 PCR检测
  • 2.7.2 转基因烟草Southern blotting分析
  • 2.7.3 RNA的提取及RT-PCR
  • 2.8 盐芥和转基因烟草的叶绿体分离及磷转运活性测定
  • 2.8.1 叶绿体的分离
  • +/Pi转运体磷转运活性的测定'>2.8.2 叶绿体上Na+/Pi转运体磷转运活性的测定
  • 2.9 烟草种子在低磷培养基上的萌发
  • 2.10 烟草植株溶液培养处理
  • 第三部分 实验结果
  • +/Pi转运体基因的Southern blotting分析'>3.1 盐芥Na+/Pi转运体基因的Southern blotting分析
  • +/Pi转运体基因全长序列的获得'>3.2 盐芥Na+/Pi转运体基因全长序列的获得
  • +/Pi转运体在酵母中的定位'>3.3 去除信号肽以后Na+/Pi转运体在酵母中的定位
  • 3.4 植物表达载体的构建和转基因植株的产生
  • +/Pi转运体活性测定'>3.5 叶绿体分离与Na+/Pi转运体活性测定
  • 3.5.1 盐芥叶绿体在不同pH下的磷转运活性
  • 3.5.2 转基因烟草叶绿体磷转运活性的测定
  • 3.6 转基因烟草具有较好的耐低磷特性
  • 3.7 植物RNAi干扰载体PFGC5941-NP的构建
  • 第四部分 讨论
  • +/Pi转运体基因功能的初步确定'>Na+/Pi转运体基因功能的初步确定
  • 盐芥叶绿体在不同pH下的磷转运活性
  • +/Pi转运体基因促进转基因烟草在磷胁迫条件下的生长'>Na+/Pi转运体基因促进转基因烟草在磷胁迫条件下的生长
  • 参考文献
  • 致谢
  • 攻读学位期间发表的学术论文
  • 学位论文评阅及答辩情况表

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