二倍体马铃薯原生质体培养及体细胞杂交的研究

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马铃薯是第四大粮食作物,产量高,用途广泛。马铃薯青枯病是由细菌引起的土传毁灭性病害,选育抗性品种是最为经济有效的途径;而块茎炸片颜色是评价马铃薯炸片品质优劣的重要指标,目前市场上急需炸片颜色好的加工专用品种。自然界存在着丰富的抗青枯病和炸片颜色优良的二倍体野生种和原始栽培种资源,但由于生殖障碍的存在使常规育种难以利用这些资源,本论文通过对二倍体马铃薯原生质体培养和体细胞杂交的研究,建立和优化原生质体培养及体细胞杂交技术体系,获得以下主要研究结果:1.植物组织培养中常伴有乙烯积累,影响植株形态建成和器官生长发育。首次系统地研究了不同浓度硫代硫酸银(Silver thiosulfate, STS)对马铃薯试管苗生长和相关生理指标的影响,结果表明:在培养基中附加1 mg/L STS可增加试管苗叶面积和叶绿素含量,抑制气生根的产生,增加单株叶面积和叶绿素含量,降低可溶性蛋白、脯氨酸和丙二醛含量;试管苗在附加2 mg/L STS培养基上没有出现形态异常现象,但生理指标表明该浓度已经对试管苗产生了一定的毒害;培养基中附加4 mg/L以上STS,试管苗出现紫色色素沉积、叶片背面生成愈伤等畸形现象,形态和生理指标显示有明显的毒害作用。培养基中蔗糖浓度及培养器皿通气状况与乙烯积累的程度密切相关,研究不同蔗糖浓度以及不同通气条件下培养基中加1mg/L STS对试管苗生长的影响,结果表明:培养基中加1mg/L STS,试管苗叶面积、单株鲜重及叶绿素含量在含有2～3%蔗糖的培养基上显著增加;通气可降低试管苗高度,增加叶面积和叶绿素含量,培养基中加1mg/L STS于半通气条件下培养,试管苗叶面积和叶绿素含量最高,丙二醛含量最低;含有2～3%蔗糖的培养基中附加1mg/L STS,半通气条件下有利于二倍体马铃薯原生质体供体材料的培养。2.正常生理代谢状况下活性氧处于动态平衡状态,参与调控细胞周期、细胞壁的松弛与重建等多种生理活动,活性氧积累能引起代谢紊乱和细胞死亡。对不同分裂能力的马铃薯原生质体分离过程中活性氧及抗氧化酶活性进行了研究,结果表明:酶解早期(8h以前)ED13的H2O2含量要显著高于无分裂能力的DH405;ED13的SOD活性酶解后期(酶解8小时后)低于DH405,而CAT活性在酶解前期(酶解8小时前)高于DH405。可以推测,原生质体分裂能力上的差异与活性氧及抗氧化酶活性有关。3.马铃薯原生质体培养成功是体细胞杂交的基础,二倍体马铃薯原生质体培养研究结果表明:叶片悬浮培养和整株黑暗培养两种预处理方式原生质体产量和活力差异不显著;以0.5mol/L甘露醇为渗透调节剂、25℃酶解12h的条件下,适宜CE171和DH401酶解的纤维酶浓度略高于ED13、HS66和DH405,分别为0.3%和0.4%;ED13和DH401原生质体在VKM液体培养基中培养3～4周,经愈伤组织生长培养基培养2周,转至芽诱导培养基2个月后出现第1个芽,芽转接在MS培养基上2周后形成具根茎叶的完整植株,HS66和CE171原生质体可形成愈伤组织,但没有分化出芽;DH405原生质体不分裂。4.对二倍体马铃薯原生质体电融合参数的研究结果表明,交流电场强度为156V/cm作用时间10s或交流电场强度为50V/cm作用时间30s,直流电电场强度为1250V/cm脉冲时间为45μs时,细胞融合效果较好;242块愈伤组织有23块分化,经SSR标记鉴定11株为融合植株,其中1株可能为不对称杂种。

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Abstract

第一章绪论

1.1 植物原生质体培养研究概况

1.1.1 影响原生质体分离的因素

1.1.2 原生质体纯化方法

1.1.3 原生质体培养方法

1.2 体细胞杂交研究进展

1.2.1 聚乙二醇法和电融合法在体细胞杂交中的应用

1.2.2 对称和不对称杂交方式在体细胞杂交中的应用

1.2.3 杂种细胞筛选方法研究进展

1.2.4 体细胞杂种鉴定方法研究进展

1.3 体细胞杂交技术在马铃薯遗传改良中的应用

1.3.1 创造抗病新种质

1.3.2 创造抗霜冻新种质

1.3.3 创造雄性不育新种质

1.3.4 创造遗传研究新种质

1.4 立题依据

1.5 研究内容

第二章硫代硫酸银对二倍体马铃薯试管苗生长和生理特性的影响

2.1 引言

2.2 材料和方法

2.2.1 试验材料

2.2.2 试验设计

2.2.3 生长和生理指标测定

2.3 结果与分析

2.3.1 不同浓度硫代硫酸银对试管苗生长和生理特性的影响

2.3.2 不同蔗糖浓度下硫代硫酸银对试管苗生长及丙二醛含量的影响

2.3.3 不同通气条件下硫代硫酸银对试管苗生长及丙二醛含量的影响

2.4 讨论

2.4.1 硫代硫酸银浓度对试管苗生长和生理特性的影响

2.4.2 硫代硫酸银对试管苗产生毒害的浓度

2.4.3 蔗糖与硫代硫酸银对试管苗生长及膜脂质过氧化的影响

2.4.4 通气与硫代硫酸银对试管苗生长及膜脂质过氧化的影响

2.5 结论

第三章原生质体分离过程中活性氧及抗氧化酶活性的研究

3.1 引言

3.2 材料和方法

3.2.1 试验材料

3.2.2 溶液组成

3.2.3 原生质体分离纯化

3.2.4 测定项目及方法

3.3 结果与分析

3.3.1 酶解时间对原生质体产量、活力和细胞分裂的影响

2O₂含量的变化'>3.3.2 原生质体分离过程中H₂O₂含量的变化

3.3.3 原生质体分离过程中可溶性蛋白含量的变化

3.3.4 原生质体分离过程中SOD、CAT 活性的变化

3.4 讨论

3.4.1 原生质体分离与活性氧

3.4.2 原生质体分裂能力与抗氧化酶活性

3.4.3 原生质体分裂能力与蛋白质含量

3.5 结论

第四章马铃薯原生质体培养体系的建立

4.1 引言

4.2 材料和方法

4.2.1 试验材料

4.2.2 培养基组成

4.2.3 倍性鉴定方法

4.2.4 预处理方法

4.2.5 原生质体分离和纯化

4.2.6 原生质体培养

4.3 结果与分析

4.3.1 供体材料的倍性鉴定

4.3.2 不同预处理对原生质体产量和活力的影响

4.3.3 酶解液组成及酶解时间对原生质体分离的影响

4.3.4 原生质体培养及植株再生

4.4 讨论

4.4.1 影响原生质体持续分裂的因素

4.4.2 影响愈伤组织分化的因素

4.5 结论

第五章马铃薯体细胞杂交的研究

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.2.1 试验材料

5.2.2 试验方法

5.3 结果与分析

5.3.1 PEG 诱导原生质体融合过程

5.3.2 电融合过程中融合参数的研究

5.3.3 SSR 标记鉴定体细胞杂种

5.4 讨论

5.4.1 化学融合与电融合

5.4.2 体细胞杂种的鉴定

5.5 结论

第六章全文结论

参考文献

致谢

作者简历

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