东北小麦白粉病菌群体遗传结构与分子检测技术研究

论文摘要

小麦白粉病是我国及东北春麦区的重要小麦病害。小麦白粉病的经济有效防控办法就是首先使用抗病品种,再结合建立在准确预测预报基础上的适时药剂防治。本文围绕这个控制小麦白粉病的原理展开了相关研究。首先研究了2007～2008年东北春麦区及山东、河南、湖北冬麦区小麦白粉病菌（Blumeria graminis f.sp.tritici）种群动态并分析了小麦生产品种（系）的抗白粉病性（基因）。利用ISSR分子标记技术分析了上述地区间的小麦白粉病菌遗传多样性,对病菌毒性多态性进行了聚类分析,比较了小麦白粉病菌遗传多样性、毒性多态性和地域之间的关系,试图为以前报道的“东北春麦区白粉病初菌源来自山东等南部冬麦区”的结论提供DNA分子证据。针对小麦白粉病的ITS区域,应用常规PCR,DAN Dot-blot和Real-time PCR三种方法分别研究了小麦白粉病菌快速分子检测技术,试图为小麦白粉病的流行测报提供新的分子生物学手段。此外,还研究了针对另三种重要小麦病害（纹枯病、散黑穗病和赤霉病）的PCR检测技术。通过上述研究,取得了如下主要进展:1.开展了小麦白粉病菌种群动态与品种抗性（基因）分析。种群动态分析结果表明:从223个菌株中鉴定出61个生理小种。其中在东北春麦区,2007年的的优势小种为17号小种,其出现频率为10.2%;2008年则411号小种出现频率最高,为20.9%;11号、415号、611号和631号小种出现频率也呈现逐年升高的趋势。2008年在山东、河南、湖北冬麦区出现频率最高的为1号小种,出现频率为16.4%。毒性基因分析结果表明,毒性基因V2,V4b,V2+6,V4+8,V12,V13,V16,V18,V20,V21,V22和V23的毒性频率在0.0%～29.9%之间,其对应的抗性基因Pm2,Pm4b,Pm2+6,Pm4+8,Pm12,Pm13,Pm16,Pm18,Pm20,Pm21,Pm22和Pm23的抗性较强,可作为有效的抗病基因加以利用。白粉病菌的联合毒性测定结果表明,147个白粉病菌单孢子堆分离物中含有9个毒性基因组合的出现频率最高,达到15.64%,V1,V3c,V5,V6,V7,V8,V17等毒性基因组合频率也较高,说明病菌在很大程度上可以联合致病。小麦品种抗性（基因）测定结果表明,302份小麦品种中85%的品种为感病,对其中抗性较好的10份材料进行了抗性基因推导分析,表明小麦品种‘保丰104’含抗性基因Pm2+6,品种‘Sunwon85’和‘WF08-182’均含抗性基因Pm5+Pm8,‘京冬8号’和‘西峰20’含抗性基因Pm2+Pm8,‘南大2419’和‘川育55871’含有Pm24+Pm8,‘兰天18’含有与Era相同的抗性基因,‘兰天17’和‘绵阳28’含有未知的抗性较强的基因。2.利用筛选的18条ISSR引物对来自东北春麦区的12个白粉菌株和山东冬麦区的14个菌株进行了遗传多样性分析,构建了26个小麦白粉病菌的遗传聚类分析图。结果表明:条带相似系数在0.56～0.82,并在相似系数0.61处可聚为四类,一类包括13个菌株,分别为辽宁的11号、17号、7号、411号小种,山东的11号、411号小种,河南的35号、11号、711号、331号小种,湖北的11号、31号、21号小种。二类包括2个菌株,分别为山东的611号小种和辽宁的311号小种。三类包括10个菌株,分别为辽宁的431号、55号小种、611号、631号、731号和77号小种,山东的431号、731号小种,湖北的631号、731号小种。四类包括1个菌株,为辽宁的23号小种。26个菌株的病菌毒性分子聚类分析结果表明:条带相似系数在0.52～1.00,在相似系数0.70处可聚为三类,一类包括3个菌株,分别为辽宁的17号小种、辽宁的55号小种和辽宁的77号小种。二类包括2个菌株,为辽宁的7号小种和23号小种,其它的21个菌株归为第三类。以上结果表明了东北与山东两地的小麦白粉病菌间有较高的DNA亲缘关系。3.应用常规PCR、DNA斑点杂交和实时荧光PCR三种现代分子生物学方法对小麦白粉病菌进行了检测研究,结果表明:（1）设计和筛选的常规PCR引物XBFF/R均能得到全部8个小麦白粉病不同小种的PCR产物,其片段长度同为352bp,而9种供试参考病原菌（黄瓜白粉病菌、小麦条锈病菌、小麦叶锈病菌、小麦秆锈病菌、小麦赤霉病菌、小麦纹枯病菌、小麦散黑穗病菌、玉米纹枯病菌及玉米丝黑穗病菌）及对照均未扩增出条带。设计和筛选的DAN斑点杂交探针检测8个白粉小种均表现为阳性,而9种参考病原菌均呈现为阴性反应。设计和筛选的实时荧光PCR引物XBFTF/R及TaqMan探针XBFTP,检测8个小麦白粉病菌小种也均采集到强的荧光信号,dRn值为0.35～0.45,Ct值为15.92～18.53,表现为强阳性扩增,9种参考病原菌及对照均无荧光信号增加,表现为阴性。说明三种方法中设计与筛选的引物及探针对小麦白粉病菌均具有高度特异性,可以作为一种小麦白粉病菌的特异性检测与诊断的手段。（2）三种检测方法的灵敏度的测定与比较结果表明:常规PCR引物XBFF/R检测到的最低DNA模板浓度为10pg,DNA斑点杂交方法最低检测限为1pg,实时荧光PCR最低检测限为1fg。（3）用常规PCR和实时荧光PCR两种方法对温室接种的小麦白粉病进行了检测,并在时间上与自然显症的观察进行了比较,结果表明:在温室条件下,小麦白粉病菌在接种后第5d时开始出现小麦白粉病病斑,而利用常规PCR引物XBFF/R可在接种第3d检测到小麦白粉病菌,比自然显症观察能够提前了2d检测到白粉病菌;实时荧光PCR法可在接种后1d即能检测到小麦白粉病菌,比自然显症观察能够提前了4d检测到白粉病菌,这可为白粉菌的预测或预警检测提供依据,更可为白粉病在流行前制定防治决策赢得宝贵时间。4.本文还通过对小麦纹枯病、小麦散黑穗病、小麦赤霉病病原菌的ITS序列的分析,分别设计和筛选出了三种病原菌的PCR引物,并对三种病害进行了特异性检测,结果表明,小麦纹枯病菌引物XWKF/R对所有供试菌株的DNA进行PCR扩增,只有小麦纹枯病菌扩增出大小为467bp的条带,9种参比病原菌全部均未扩增出条带;小麦散黑穗病菌引物XSHF/R仅能扩增出小麦散黑穗病菌的大小为533bp的条带,所有9种参比病原菌全未扩增出条带。同样,小麦赤霉病菌引物XCMF/R只对小麦赤霉病菌能扩增出大小为401bp的条带而参比病菌全未有条带产生。说明筛选的三对引物对三种病害都各具有特异性。引物灵敏性检测结果表明,引物XWKF/R,XCMF/R分别能够检测出浓度为10pg的小麦纹枯病菌和小麦赤霉病菌,而引物XSHF/R对小麦散黑穗病菌的检测限为1pg。以上结果说明用筛选的三种病原菌的特异性引物可以作为三种病害的检测手段加以利用。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1 小麦白粉病生理分化及抗性基因分析研究进展
• 1.1 小麦白粉病菌种群动态分析
• 1.2 小麦生产、后备品种（系）对小麦白粉病菌抗性鉴定及抗性基因分析
• 2 DNA分子标记技术在植物病原真菌遗传多样性研究中的进展
• 2.1 植物病原真菌群体遗传多样性的研究
• 2.2 病原菌遗传多样性的分子检测
• 2.3 小麦白粉病菌遗传多样性研究进展
• 3 植物病害DNA分子快速诊断技术研究进展
• 3.1 植物病害DNA分子检测技术及原理
• 3.2 植物病害DNA分子快速检测与诊断的意义
• 3.3 PCR技术在植物病害检测中的应用
• 3.4 构建基因芯片
• 第二章 小麦白粉病菌种群变异动态分析及生产品种（系）抗性基因推导
• 1 材料
• 2 实验方法
• 3 结果与分析
• 3.1 小麦白粉病菌子囊孢子形成
• 3.2 小麦白粉病菌生理小种变异分析
• 3.3 小麦白粉病菌毒性基因分析
• 3.4 小麦生产品种（系）对小麦白粉病菌的抗性鉴定及抗性基因分析
• 4 讨论
• 第三章 小麦白粉病菌遗传多样性ISSR分析
• 1 材料
• 2 实验方法
• 3 结果与分析
• 3.1 小麦白粉病菌DNA提取结果
• 3.2 分光光度计检测基因组DNA浓度及纯度分析结果
• 3.3 ISSR引物扩增结果
• 3.4 26个小麦白粉病菌菌株的ISSR聚类分析
• 3.5 26个小麦白粉病菌菌株毒性多态性分析
• 4 讨论
• 第四章 小麦白粉病菌DNA分子检测技术研究
• 第一节 小麦白粉病菌常规PCR检测
• 1 材料
• 2 实验方法
• 3 结果与分析
• 3.1 基因组DNA提取结果
• 3.2 ITS引物PCR扩增产物电泳结果
• 3.3 小麦白粉病菌常规PCR引物设计
• 3.4 小麦白粉病菌常规PCR引物的特异性检测
• 3.5 小麦白粉病菌常规PCR引物灵敏性检测
• 4 小结
• 第二节 小麦白粉病菌DNA DOT-BLOT杂交检测
• 1 材料
• 2 实验方法
• 3 结果与分析
• 3.1 小麦白粉病菌Dot-blot探针的设计结果
• 3.2 小麦白粉病菌Dot-blot探针的特异性检测
• 3.3 小麦白粉病菌Dot-blot探针灵敏性检测
• 4 小结
• 第三节 小麦白粉病菌REAL-TIME PCR检测
• 1 材料
• 2 实验方法
• 3 结果与分析
• 3.1 小麦白粉病菌Real-time PCR引物及探针的设计结果
• 3.2 小麦白粉病菌Real-time PCR探针浓度的优化
• 3.3 小麦白粉病菌Real-time PCR引物及探针特异性检测
• 3.4 小麦白粉病菌Real-time PCR引物及探针灵敏性检测
• 4 小结
• 第四节 温室人工接种小麦白粉病菌的检测
• 1 材料
• 2 实验方法
• 3 结果与分析
• 3.1 小麦白粉病菌温室条件下培养调查结果
• 3.2 常规PCR引物对接种小麦白粉病菌叶片的检测结果
• 3.3 小麦叶片中小麦白粉病菌的实时荧光PCR检测
• 4 小结
• 第五节 讨论
• 第五章 小麦三种病害病原菌分子检测
• 1 材料
• 2 实验方法
• 3 结果与分析
• 3.1 小麦病害病原菌PCR引物设计结果
• 3.2 三种病菌PCR引物特异性检测
• 3.3 三种病菌PCR引物灵敏性检测
• 4 讨论
• 第六章 结论与展望
• 1 结论
• 2 有待于进一步开展的工作
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位论文期间发表文章