河蟹酶解液的氨基酸分析及酶解工艺条件的优化研究

论文摘要

中华绒螯蟹（又称河蟹，大闸蟹），其营养丰富，味道鲜美，在我国的养殖业和饮食文化中有着重要的地位。现阶段对蟹的深加工有限，且加工品的价格仍然较为低廉，粗加工过程产生的蟹脚、低值螃蟹、甲壳等废弃物，不仅对环境产生污染还造成了蛋白质的浪费。本文以沱湖大闸蟹为试验原料，采用复合酶水解蛋白质技术分析酶解的最佳工艺并通过高效液相色谱法检测不同水解度下呈味物质与水解度之间的相关性；经过一系列的测定和凝胶色谱分析其分子量分布后采用最佳工艺条件下的酶解液按比例加工成鲜味饱满、营养丰富的蟹味产品。本文对响应面法酶解河蟹的工艺进行了优化研究，具体研究内容如下：第一，本试验通过对比研究了在各自适度酶解条件下木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、复合风味酶、双酶水解河蟹的效果，根据水解度指标选择出木瓜蛋白酶和风味酶做为复酶配合使用，且风味酶在全部水解时间1/4的时间添加，水解度（DH）值最大。第二，以水解度为指标，在粗略的水解条件下选择加酶量、时间、温度、pH值四个因素三水平设计正交试验，总模型设计的结果分析表明，影响水解度的因素依次是：pH>加酶量>时间>温度。综合极差分析和方差分析结果，初步确定较佳酶解工艺条件为A1B1C1D2，即pH5.5、温度45℃、加酶量4000U、酶解时间为5h。第三，以邻苯二甲醛（OPA）为衍生剂，采用反相高效液相色谱法测定了冷冻河蟹的酶解液中氨基酸组成；并对谷氨酸连续重复五次进样对试验方法的精密度进行了计算。结果说明，氨基酸的保留时间RSD为0.78%，峰面积的RSD为4.54%，说明该方法稳定，精密度良好，而且可以灵敏、可靠的测定河蟹蛋白酶解液中的15种氨基酸含量。酶解液的OPA柱前衍生化法分析结果中，谷氨酸含量达到827μg/g，占到氨基酸总量的3.80%。鲜味特征物质主要为谷氨酸和天冬氨酸约占到总量的7%。河蟹酶解液中的游离氨基酸含量较高，必需氨基酸含量占氨基酸总量的34.7%-46.8%，可见，蟹肉不仅具有鲜美的风味，而且氨基酸组成全面均衡，是营养食品的优质来源。第四，本试验对呈鲜味氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸）、必需氨基酸、氨基酸的总量与水解度进行相关性分析，采用SAS中的偏相关分析对数据进行处理，结果表明呈鲜、必需、总氨基酸与水解度都呈正相关关系。而且呈鲜味氨基酸与水解度之间的相关性显著。随着水解度的增大，必需氨基酸和氨基酸总量也在增加，但相比较而言，呈鲜特征氨基酸的含量得到了较显著的增长。这也说明可以将水解度作为优化酶解工艺、衡量鲜味程度的一个重要指标。第五，采用柱层析法将酶解液进行分子量分析。根据洗脱先后顺序水解度依次为：12.71%、14.01%、15.06%、18.01%、20.85%、21.09%，结果说明随水解度的增大，大分子量的峰逐渐减小且有一个渐进的往后推移趋势；小分子量的峰逐渐增大后移。第六，在单因素酶解试验的基础上，采用SAS统计分析中的二次通用旋转，进行响应面分析，建立了以水解度DH为响应值，建立复合酶解蟹肉蛋白的二次多项数学模型。通过响应面优化器分析，最优水解条件为：pH为5，温度为55°C，加酶量为5500U，酶解时间为6h。通过重复试验，方差和可信度分析表明，模型拟合度较好。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 1 文献综述
• 1.1 河蟹加工概述
• 1.2 复合调味品
• 1.3 海鲜调味料概述
• 1.4 蛋白质水解技术现状
• 1.5 液相色谱法分析酶解产物中氨基酸的现状
• 1.6 酶解产物的中蛋白质分子量的测定研究
• 1.7 试验用酶
• 2 引言
• 2.1 课题研究意义
• 2.2 研究内容
• 3 材料与方法
• 3.1 材料、仪器和试剂
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 主要仪器及设备
• 3.1.3 主要试剂
• 3.2 原料分析
• 3.2.1 粗蛋白质的测定
• 3.2.2 蛋白酶酶活
• 3.3 酶解工艺指标的测定方法
• 3.3.1 氨基态氮的测定
• 3.3.2 水解度的测定
• 3.4 游离氨基酸定量分析
• 3.4.1 反相色谱法
• 3.4.2 色谱条件
• 3.4.3 标准溶液的配制
• 3.4.4 衍生化操作
• 3.4.5 标准曲线的绘制
• 3.4.6 精密度试验
• 3.5 酶解液的水解度与氨基酸含量的相关性研究
• 3.5.1 酶解液制备工艺流程
• 3.5.2 水解酶的选择
• 3.5.3 酶解反应的正交设计
• 3.5.4 氨基酸的含量与水解度的相关性分析
• 3.6 酶解产物分子量的变化研究
• 3.6.1 葡聚糖凝胶的预处理
• 3.6.2 装柱
• 3.6.3 平衡
• 3.6.4 洗脱液的配置
• 3.6.5 标准曲线的绘制
• 3.6.6 样品洗脱
• 3.7 酶解工艺的优化
• 3.7.1 酶解河蟹的单因素试验
• 3.7.2 二次通用旋转设计优化工艺
• 3.7.3 数据分析
• 4 结果与分析
• 4.1 河蟹肉中粗蛋白的测定
• 4.2 蛋白酶酶活的测定
• 4.3 蛋白酶的选择
• 4.4 正交试验结果
• 4.5 酶解液中不同水解度游离氨基酸的 RP-HPLC 定量
• 4.5.1 回归方程
• 4.5.2 酶解液中氨基酸含量的测定结果
• 4.5.3 精密度
• 4.6 氨基酸与水解度的相关性研究
• 4.7 葡聚糖凝胶层析法定性蛋白质分子量的结果
• 4.7.1 标准曲线的制作
• 4.7.2 样品分子量分析结果
• 4.8 酶解工艺的深入研究
• 4.8.1 酶解时间的选择
• 4.8.2 pH 值的选择
• 4.8.3 酶解温度的选择
• 4.8.4 不同加酶量对酶解效果的影响
• 4.8.5 试验设计及响应值
• 4.8.6 水解条件的响应面分析与优化
• 4.8.7 酶解最佳条件优化与验证
• 4.9 固体蟹香调味品的研制
• 5 讨论
• 6 主要结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 硕士期间发表的论文
• 本科和硕士期间获得奖励
• 附录