用于有机磷农药残留检测的免疫生物传感器的研究

论文摘要

农药广泛用于农业生产中,给社会带来了巨大的经济效益。另一方面,农药的广泛使用也会给环境和人类健康带来严重的影响。农药的定性和定量检测的标准方法是基于色谱方法,如气相色谱、高效液相色谱以及与质谱的联用。这些分析技术灵敏可靠,但费时,昂贵,只能由专业人员操作,体积较大,携带不太方便,不适合于现场或野外使用。由于农药的大量使用,迫切需要建立和发展一些快速检测方法。生物传感器是将生物识别元件和信号转换元件紧密结合,从而检测目标物的分析装置,免疫传感器作为其中的一个分支,在农药残留检测领域潜力巨大。由于有机磷农药使用最为广泛,本论文以有机磷农药为对象,研究了电化学、压电及光学等免疫传感器用于农药残留的检测方法。本文的主要内容和研究结果如下：（1）探索了电化学阻抗谱用于农药残留检测的可行性。研究表明,在电极修饰、抗体固定及对农药抗原的识别过程中,电化学阻抗谱能很好地与等效电路模型相吻合。利用Nyquist图谱,测量出电极表面的电子转移电阻（Ret）、溶液电阻（Rs）、恒相位元件（CPE）及双层板电容（Cdl）值的变化。结果显示：Rs和CPE之间没有显著的差异,而Ret和Cdl的变化比较显著。包被抗体与待测溶液中的农药抗原反应后,在0.01μg/mL-100μg/mL浓度范围内,电子转移电阻和浓度呈良好的相关关系。回归方程为：y=250.54Ln（x）+1925.2,决定系数R2为0.9705。检测下限为2.3×10-μg/mL。在用于实际水样的检测中,三个添加浓度的平均回收率分别为：85.3%、116.7%和101.4%；变异系数分别为：10.6%、13.7%和14.5%。另外,将农药抗体固定在磁性纳米颗粒上,用来捕获待测农药抗原,通过流动芯片进行检测,在Bode图上可以很好的区分出不同浓度的农药抗原。（2）研究了压电免疫传感器结合流动注射系统用于对硫磷农药残留的检测。结果显示,农药浓度在0.1-50μg/mL范围内,直接法压电免疫传感器的频率变化与浓度之间成良好的相关关系,回归方程：y=10.827x+22.133。决定系数R2为0.9862,最低检测限为3.38×10-2μg/mL。为了有效地检测待测农药,比较了五种方法用于抗体在石英晶体金电极表面的固定,综合考虑灵敏度和重复性两个指标,蛋白A法和硅烷化法这两种方法固定效果较好。AFM图像可以很好地表征抗体在电极表面的固定情况。（3）为了降低检测限,提高灵敏度,将固定抗体竞争法和固定抗原竞争法用于石英晶体微天平的农药残留检测中。在固定抗体竞争法检测中,对所用包被抗体浓度进行了优化,抗体稀释倍数为1：30,人工抗原浓度为80μg／mL时,其频率变化与待测农药浓度在0.5 ng/mL～5μg/mL的范围内成相关关系,回归方程为：y=11.555Ln（x）-158.1,决定系数R2为0.9664。最低检测限为6.19×10-2ng/mL。在固定抗原竞争法检测中,考察了传感器固定不同浓度的人工抗原时检测性能差异。结果表明固定抗原的浓度为200μg/mL, pH为7.4时,固定效果最佳。在0.5 ng/mL～5μg/mL范围内,传感器的频率改变值与浓度的回归方程为：y=15.711 Ln（x）-203.85,决定系数R2为0.9522。最低检测限为9.53×10-2 ng/mL。此传感器能够重复使用,选择性好。此外,循环伏安曲线可以很好地表征电极表面的修饰及免疫反应的进行。（4）建立了一种基于毛细管的光学免疫传感器,将抗原-抗体反应与生物素亲和素体系相结合用于三唑磷农药的检测。将间接免疫竞争法用于光学免疫传感器中,辣根过氧化物酶（HRP）酶标物催化四甲基联苯胺（TMB）底物,在655nm下测得产物吸光度,待测农药的浓度与吸光度成反比。在1 ng/mL～1μg/mL浓度范围内,A／Ao与农药浓度的对数之间呈线性相关,标准曲线为：y=-25.96x-102.09,决定系数为：R2=0.9874。用Ao-2SD法,计算出检测限为1.8ng/mL。将此传感器用于水样、茶叶及梨的检测中,测得的三唑磷农药在三种样品中的含量均值分别为：9.7 ng/mL,6.4 ng/mL和3.5 ng/mL。分别研究了三种样本中两个水平的添加回收率。水样中为：103.7%,104.8%；茶叶为78.7%,85.6%；梨为103.5%,105.6%。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 插图清单
• 表格清单
• 英文缩略表
• 第一章 绪论
• 1.1 农药残留及检测现状
• 1.1.1 色谱法
• 1.1.2 免疫分析法
• 1.1.3 酶分析法
• 1.1.4 活体测定法
• 1.2 农药残留速测标准及国内研究进展
• 1.3 农药残留检测方法中尚存的问题
• 1.4 本文研究目标和研究内容
• 1.4.1 选题的目的和意义
• 1.4.2 研究目标和研究内容
• 1.4.3 技术路线
• 1.5 本章小结
• 第二章 生物传感器及其在农药残留检测中的应用
• 2.1 生物传感器技术概述
• 2.2 酶传感器在农药残留检测中的应用
• 2.3 免疫传感器在农药残留检测中的应用
• 2.3.1 免疫传感器的类型
• 2.3.2 电化学免疫传感器
• 2.3.3 光学免疫传感器
• 2.3.4 压电免疫传感器
• 2.3.5 纳米机械臂免疫传感器
• 2.4 本章小结
• 第三章 用于有机磷农药检测的电化学阻抗免疫传感器研究
• 3.1 电化学阻抗谱理论
• 3.1.1 电化学系统
• 3.1.2 电化学阻抗谱
• 3.1.3 Randles等效电路
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 材料和试剂
• 3.2.2 仪器
• 3.2.3 ITO电极表面修饰及测量
• 3.2.4 抗体在磁珠表面的固定
• 3.2.5 微流控芯片电极表面修饰及样品测量
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 ITO免疫电极的制备
• 3.3.2 等效电路
• 3.3.3 ITO电极在电解液中的交流阻抗图谱
• 3.3.4 ITO电极抗体包被时间的优化
• 3.3.5 ITO免疫电极在用于有机磷农药的检测
• 3.3.6 灵敏度及准确度
• 3.3.7 再生及重复性
• 3.3.8 特异性
• 3.3.9 微流控芯片结合纳米磁珠的农药检测
• 3.4 本章小结
• 第四章 基于直接法压电免疫生物传感器的农药残留检测研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 实验材料及试剂
• 4.2.2 仪器设备
• 4.2.3 实验方法
• 4.2.4 数据处理
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 电极的清洗
• 4.3.2 抗体浓度与抗体固定量的选择
• 4.3.3 AFM图像表征
• 4.3.4 抗体固定方法的比较
• 4.3.5 培育时间的选择
• 4.3.6 pH值的选择
• 4.3.7 流动注射检测
• 4.3.8 样本中痕量农药的检测
• 4.3.9 传感器特异性与电极再生
• 4.3.10 传感器的稳定性
• 4.3.11 免疫反应结合常数
• 4.4 本章小结
• 第五章 基于竞争型压电免疫生物传感器的农药残留检测研究
• 5.1 引言
• 5.2 材料和方法
• 5.2.1 实验材料及试剂
• 5.2.2 仪器设备
• 5.2.3 实验方法
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 竞争型反应免疫传感机理
• 5.3.2 循环伏安法（CV）表征
• 5.3.3 固定抗体免疫电极检测
• 5.3.4 固定抗原免疫电极检测
• 5.3.5 特异性试验
• 5.4 本章小结
• 第六章 基于生物素—亲和素免疫放大技术的毛细管柱检测三唑磷农药的研究
• 6.1 引言
• 6.2 材料和方法
• 6.2.1 实验材料及试剂
• 6.2.2 仪器设备
• 6.2.3 实验方法
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 毛细管柱固定抗原及免疫检测机理
• 6.3.2 包被抗原的浓度及毛细管的选择
• 6.3.3 酶的选择
• 6.3.4 底物的选择
• 6.3.5 校准曲线
• 6.3.6 准确度检测
• 6.3.7 特异性检测
• 6.4 本章小结
• 第七章 结论与展望
• 7.1 创新点及结论
• 7.2 研究展望
• 参考文献
• 作者简介