论文摘要
本文以大田中发生严重的鸭跖草为靶标,从辽宁省不同地区鸭跖草叶片上分离筛选出对鸭跖草致病力强,对大多数作物安全的草茎点霉SYAU-06菌株。通过对SYAU-06活体菌株的寄主范围、生物学特性、侵染过程、侵染影响因子和毒素的除草活性、提取工艺、作用机理、生物安全性、分离提纯技术研究以及结构解析,从活体菌株和毒素两个方面系统评价了SYAU-06菌株防除鸭跖草的潜力,为鸭跖草的生物防治提供新的方法和思路。1.对鸭跖草病原真菌进行了筛选。从辽宁省不同地区采集的鸭跖草叶片上共分离到7种植物病原真菌,通过形态鉴定分别为草茎点霉（Phoma herbarum）,新月弯孢（Curvularia lunata）,平脐蠕孢属（Bipolaris sp.）,突脐蠕孢（Exserohilum sp.）,交链孢菌（Alternaria alternata）,胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）和灰梨孢霉（pyricularia grisea）。分离到的7种植物病原真菌经致病力和安全性测定显示,草茎点霉对鸭跖草的致病力最强,病叶率和病情指数分别为95.67%和76.42,对大多数作物安全,仅对玉米幼苗造成轻微伤害,而不影响其生长发育;新月弯孢、平脐蠕孢、突脐蠕孢、胶孢炭疽菌、梨孢霉对鸭跖草的致病力较低,病叶率低于50%,病情指数小于20;交链格孢菌接种鸭跖草后病叶率60%,病情指数21.14,但中度侵染水稻和玉米。通过测定菌株28SrDNA序列并进行序列比对,有4个草茎点霉菌（P.herbarum）序列与01菌株的相似性达98%以上,从分子水平进一步证实01菌株为草茎点霉。通过单孢分离从不同地区的鸭跖草叶片上共获得11株草茎点霉,比较了不同分离菌株在培养特征、致病性、产毒能力方面的差异并运用RAPD方法分析了不同菌株的遗传差异。从本溪地区分离的SYAU-06菌株在生长速度、产孢量和产毒能力等方面均具有显著优势。SYAU-06菌株寄主范围测试表明在供试的7科18种大田作物和蔬菜中仅玉米和高粱叶片有轻微的伤害反应,在供试的14科27种杂草中,对鸭跖草高度敏感,对苋科的反枝苋、凹头苋和藜科的藜轻度敏感。从致病力和安全性的角度考虑选择草茎点霉SYAU-06菌株作为生物除草剂的候选菌,评价其对鸭跖草的除草潜力。2.系统研究了草茎点霉SYAU-06菌株生物学特性和与农药的相容性。最适合草茎点霉SYAU-06菌株菌丝生长的培养基为鸭跖草汁+葡萄糖培养基;最适合的碳源为乳糖和葡萄糖,氮源为酵母膏;最适温度为25-30℃,最适pH为8。最适合草茎点霉SYAU-06菌株形成分生孢子器的培养基为玉米粉培养基;最适温度为25-30℃,最适pH为7-8,而且光照有利于产孢,适量的紫外线照射可诱导分生孢子器的形成。分生孢子萌发最适温度为25-30℃,最适pH为7,加入营养物质如葡萄糖、蔗糖可促进分生孢子萌发。采用菌丝生长速率法和孢子萌发法测定了草茎点霉SYAU-06菌株与12种农田常用化学农药的相容性。结果表明杀虫剂与SYAU-06菌株的相容性最好,杀菌剂与SYAU-06菌株完全不相容,除草剂与SYAU-06菌株的相容性介于杀虫剂和杀菌剂之间。3.明确了草茎点霉SYAU-06菌株的侵染过程。通过显微和超微观察发现草茎点霉菌丝体接种2h细胞分裂尚未开始,接种6h菌丝顶端出现分枝,接种8h形成附着胞,接种12h通过表皮细胞中间、细胞间隙和气孔侵入叶片,接种24h叶片表皮细胞下可见到大量菌丝。4.以病叶率、病情指数和鲜重抑制率3项指标为原则,从生防真菌自身的生物学特性、杂草的发育阶段和环境条件三个方面研究SYAU-06菌株侵染鸭跖草发病的影响因子。在相同接种浓度下菌丝体对鸭跖草的侵染力最强,发病时间最早,其次是分生孢子,侵染力最弱的接种物是厚垣孢子。利用草茎点霉SYAU-06菌株成功控制鸭跖草危害,菌丝体的接种浓度要高于107mf·mL-1,培养时间控制在7-9d,寄主植物鸭跖草处于3叶期前。病害发生的最适温度范围是28-32℃,环境湿度保持在80%以上,接种后保湿时间至少需要48h,加入吐温-80和葡萄糖明显提高了生防菌的致病作用。保湿期的光照情况影响病害发生程度,光照时间越短,病害发生越严重。5.以种子萌发、胚根和胚芽伸长、植株生长量、叶片伤害反应为测定参数,明确了草茎点霉粗毒素的除草活性。在最高毒素浓度500μg·mL-1时,种子萌发的抑制率为17.89%,胚根和胚芽伸长的抑制率分别为37.26%和28.37%,植株鲜重减少了15.5%,叶片病斑面积6.53mm2。粗毒素杀草谱和对作物安全性测试结果为鸭跖草和藜对毒素最敏感,伤害反应为4级,反枝苋和虎尾草伤害反应分别为3级和1级;玉米和高粱对粗毒素敏感,小麦、大豆和花生不敏感。6.系统研究草茎点霉毒素的提取方法、提取条件和毒素的稳定性。明确草茎点霉SYAU-06菌株产生的毒素既有胞外毒素,又有胞内毒素,且用极性中等的乙酸乙酯萃取效果最好。大豆培养基和PSK分别是适合菌株生长和毒素分泌的固体培养基和液体培养基。确定有利于菌株产毒的温度为32℃、培养时间为14d、培养方式为150r·min-1振荡培养。毒素稳定性测试结果为贮存时间和光照对毒素活性没有影响,但毒素对温度比较敏感。7.阐明了草茎点霉毒素的作用机理。测定了草茎点霉毒素对鸭跖草叶片组织细胞膜透性和丙二醛（MDA）含量影响,发现毒素处理后叶片组织细胞膜透性上升,Na+和K+的渗漏量显著高于对照;膜脂过氧化加强,MDA含量增加;经毒素处理后叶片叶绿素含量下降,呼吸作用出现异常;草点霉毒素还抑制鸭跖草叶片组织中与植物抗性有关的CAT、POD、APX的活性。8.评价了草茎点霉毒素对环境生物的安全性。测定了草茎点霉毒素对柞蚕的触杀毒性LC50为58775.07 mg·L-1,胃毒毒性LD50为2359.78μg·g-1,表现为低毒;对蜜蜂、赤眼蜂、蚯蚓表现安全;12h对水蚤和96h对小球藻的毒性LC50分别为3771.97 mg.L-1和14214.68 mg·L-1,表现低毒;对土壤真菌、细菌和放线菌的数量没有影响。9.进行了草茎点霉毒素分离提纯技术的研究,初步明确了毒素纯品的结构。通过254nm、365nm紫外光显色和碘熏蒸显色筛选出毒素TLC适合的展开剂为正己烷:乙酸乙酯:甲酸的比例为（5:1:0.1）和（10:1:0.1）。利用二次硅胶柱层析和一次氧化铝柱层析得到草茎点霉毒素纯品,通过液相色谱检测纯度为97.89%。毒素组分在235nm处有最强的紫外吸收,质谱图中m/z为237.7的峰强度稳定,推测其分子量是238。红外光谱显示毒素存在-OH、-CH3、-COOH、-NO2的伸缩振动,并且存在苯环邻位取代的特征,推测除草活性组分含有邻硝基苯酸结构。