FMDV 2A介导的乳腺上皮细胞双基因表达载体构建及表达

论文摘要

本研究构建了口蹄疫病毒2A（FMDV 2A）自剪切肽介导的人白介素2基因（hIL-2）和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因双顺反子乳腺特异性表达载体,并验证其在乳腺上皮细胞中的表达。首先克隆奶山羊β-酪蛋白启动子序列,将hIL-2基因序列置于启动子之后,然后利用口蹄疫病毒2A（FMDV 2A）自剪切序列连接EGFP基因,构建出乳腺特异性的双顺反子表达载体pFIENβ,并利用脂质体转染山羊乳腺上皮细胞,最后用RT-PCR技术和Western blotting检测hIL-2基因与EGFP基因的表达。可为利用乳腺生物反应器生产具有协同作用的蛋白奠定基础。本研究获得以下结果:1.成功从人血液中提取RNA,并经RT-PCR、PCR、连接转化等试验后成功克隆出hIL-2基因,经测序分析后,表明该基因没有发生突变,可以用于后续试验。2.构建了以β-酪蛋白启动子作为调控序列,含有hIL-2基因和EGFP基因乳腺特异性的共表达载体,经酶切及测序鉴定后,证明载体构建正确,可以进行后续试验。3.以奶山羊乳腺组织为材料,利用组织块贴壁培养法培养出原代山羊乳腺上皮细胞,利用已长出上皮细胞的组织块重新移入另外一个培养皿中,成功培养出了纯化的山羊乳腺上皮细胞,且细胞经传代培养后,生长旺盛,状态良好,可以用于细胞转染试验。4.利用脂质体对乳腺上皮细胞进行转染,筛选出适合山羊乳腺上皮细胞的转染时间,转染两天后,在荧光显微镜下观察,转染重组质粒的细胞部分发出荧光,证明转染成功。提取了细胞的RNA,在mRNA水平上对目的基因进行了检测,结果显示hIL-2基因和EGFP基因在mRNA水平上得到表达,但仍需进一步进行蛋白检测。Western blotting检测结果显示,hIL-2蛋白和EGFP蛋白在细胞内都有表达,但也检测到了hIL-2/EGFP融合蛋白的存在,说明FMDV 2A发挥了剪切作用,但剪切作用并不完全。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 转基因家畜动物的现状及未来
• 1.1 转基因技术的发展
• 1.2 转基因动物在生物医学上的应用
• 1.2.1 利用转基因动物乳腺生产药物
• 1.2.2 在转基因动物中生产抗体的研究
• 1.2.3 利用转基因动物进行血液更换
• 1.2.4 异种移植
• 1.3 转基因动物在农业上的应用
• 1.3.1 改变畜禽胴体组成
• 1.3.2 促进泌乳
• 1.3.3 增加毛的生产
• 1.3.4 生产环保性动物
• 1.4 转基因动物和疾病控制
• 1.4.1 提高疾病抑制的转基因方案
• 1.4.2 转基因技术应用于乳腺疾病治疗的研究
• 1.5 新兴的转基因技术
• 1.5.1 利用慢病毒转染受精卵和卵母细胞
• 1.5.2 生产嵌合体一代
• 1.5.3 RNAi（核糖核酸干扰）
• 1.6 转基因动物的安全性
• 第二章 FMDV 2A 在构建共表达载体中的研究进展
• 2.1 利用 IRES 构建共表达载体
• 2.2 构建融合蛋白表达载体
• 2.3 利用自剪切多肽构建共表达载体
• 2.3.1 FMDV 2A 的剪切机制
• 2.3.2 FMDV 2A 在构建多顺反子表达载体中的应用
• 2.4 问题与展望
• 第三章 白细胞介素2 的研究进展
• 3.1 白细胞介素2 的一般性质
• 3.2 白细胞介素2 的生物活性
• 3.3 IL-2 的应用研究
• 第四章 本研究目的意义及技术路线
• 4.1 本研究目的意义
• 4.2 研究内容
• 4.2.1 hIL-2 基因的克隆修饰
• 4.2.2 构建具有FMDV2A 元件的hIL-2 表达载体
• 4.2.3 细胞培养
• 4.2.4 细胞转染和阳性筛选
• 4.2.5 对目的基因在阳性细胞中的表达进行鉴定
• 4.3 研究方法及技术路线
• 4.3.1 hIL-2 基因的克隆
• 4.3.2 FMDV2A 的获得
• 4.3.3 β-酪蛋白调控序列的获得
• 4.3.4 neo 基因的获得
• 4.3.5 EGFP 基因的获得
• 4.3.6 表达载体的构建
• 4.3.7 细胞转染
• 4.3.8 阳性细胞的检测
• 试验研究
• 第五章 hIL-2 基因的克隆和修饰
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 试验材料
• 5.2.2 试验方法
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 人血总RNA 的提取结果
• 5.3.2 逆转录PCR 扩增hIL-2 CDS 区结果
• 5.3.3 hIL-2 基因 CDS 区的克隆及鉴定结果
• 5.3.4 菌落测序结果
• 5.4 讨论
• 5.5 小结
• 第六章 FMDV 2A 介导的双基因乳腺特异性表达载体的构建
• 6.1 引言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 材料
• 6.2.2 方法
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 山羊β-酪蛋白启动子片段克隆及鉴定结果
• 6.3.2 EGFP 基因的克隆及鉴定结果
• 6.3.3 neo 基因的克隆及鉴定结果
• 6.3.4 双基因表达载体的构建结果
• 6.4 讨论
• 6.5 小结
• 第七章 奶山羊乳腺上皮细胞的培养
• 7.1 引言
• 7.2 材料与方法
• 7.2.1 材料
• 7.2.2 试验方法
• 7.3 试验结果
• 7.3.1 组织块贴壁培养法培养原代山羊乳腺上皮细胞
• 7.3.2 细胞的传代培养结果
• 7.4 讨论
• 7.5 小结
• 第八章 重组质粒转染山羊乳腺上皮细胞及转染后的检测
• 8.1 引言
• 8.2 材料与方法
• 8.2.1 试验试剂
• 8.2.2 试验仪器及设备
• 8.2.3 试验方法
• 8.3 试验结果
• 8.3.1 转染后细胞的EGFP 检测结果
• 8.3.2 山羊乳腺上皮细胞hIL-2 和EGFP 的mRNA 检测结果
• 8.3.3 阳性细胞中的IL-2 和EGFP 蛋白表达检测结果
• 8.4 讨论
• 8.5 小结
• 结论、创新点及不足
• 1 结论
• 2 创新点
• 3 不足之处
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介