论文摘要
第一部分人骨髓间充质干细胞体外扩增后的生物学特性及联合造血干细胞移植治疗血液病的研究目的:体外扩增源于人骨髓的间充质干细胞（MSCs）,鉴定其生物学特性,及探讨其联合造血干细胞移植治疗血液病的可行性和安全性。方法:体外扩增来自16例健康供者及4例经过化疗的恶性血液病患者的骨髓单个核细胞。扩增后的细胞经免疫表型检测、成骨和成脂肪诱导、染色体分析、衰老相关性β-半乳糖苷酶染色和与混合淋巴细胞共培养,进一步鉴定其是否为临床所需的MSCs。体外扩增后的MSCs联合造血干细胞共移植治疗血液病患者（自体移植5例、HLA全相合异基因移植15例、HLA半相合亲缘供者非去T细胞移植2例）,观察输注反应和移植后临床特征。结果:①从25.6±5.1ml骨髓（来自16例正常供者）样本中成功扩增得约（1.82±0.38）×106/kg（受者体重）MSCs,均体外培养3～4代。其免疫表型为CD73、CD90、CD105阳性,CD34、CD45、CD38、CD10、CD20、CD33、HLA-DR阴性,纯度达95%以上;具有成骨和成脂肪分化能力,可抑制MLRs中的淋巴细胞增殖,染色体核型正常,衰老相关性β-半乳糖苷酶染色绝大多数细胞呈阴性、少数呈弱阳性。②从4例化疗后的恶性血液病患者（3例NHL,1例ANLL）骨髓中分离培养获得的MSCs经扩增3～4代后获得MSCs为（1.93±0.57）×106/kg。其各项生物学特征与正常供者骨髓来源的MSCs一致。③5例进行自体外周血干细胞移植的恶性血液病患者无论是输注自体的MSCs（4例）还是异体的MSCs（1例,MSCs来自健康供者）,无输注不良反应。且患者均造血重建迅速,无严重并发症,已随访45～70月。④12例HLA全相合同胞供者移植患者输注来源于同一供者骨髓的MSCs无输注不良反应。所有患者造血重建成功,移植后一月均呈100%供者型造血。2例（16.67%）出现Ⅱ～Ⅳ度aGVHD,2例（16.67%）出现广泛性cGVHD。4例出现CMV感染,均治愈。有7例已随访29～57月,5例死亡。⑤3例HLA半相合亲缘供者非去T细胞移植患者输注来源于同一供者骨髓的MSCs无输注不良反应。所有患者造血重建成功,移植后一月均呈100%供者型造血。2例因预防或治疗疾病复发予DLI后才发生Ⅳ度aGVHD和广泛型cGVHD。另1例仅发生Ⅰ度急性GVHD和局限性慢性GVHD。2例现已分别随访了53月和43月,1例死亡。结论:体外扩增人骨髓中贴壁生长的细胞3～4代后经免疫分型检测和两系分化诱导符合MSCs,且足够数量、纯度高、核型正常、几乎没有老化,可应用于临床。在3种造血干细胞移植模式中,给患者输注体外扩增的BM-MSCs,均是安全可行的。要明确BM-MSCs输注对于移植后造血重建、免疫重建、GVHD的影响,还需要更大样本量和将患者分组统计分析。第二部分真性红细胞增多症骨髓间充质干细胞的分离培养及其功能特性的研究目的:分离、培养真性红细胞增多症（PV）患者骨髓间充质干细胞（MSCs）,并对MSCs的功能、特性进行研究。方法:采集9例初诊PV患者和6例正常个体的骨髓,应用密度梯度离心法结合贴壁培养法获取MSCs,并传代、扩增。扩增至第3代培养细胞,瑞氏染色观察细胞形态,隔天消化细胞计数绘制细胞生长曲线,电镜检测MSCs的超微结构,流式细胞术检测MSCs免疫表型和细胞周期,通过油红O染色、Von Kossa染色检测MSCs向脂肪、骨的分化,常规核型分析检测MSCs染色体,等位基因特异性-聚合酶链反应（AS-PCR）检测其JAK2V617F点突变,RT-PCR检测其造血因子在mRNA水平的表达。结果:PV和正常个体来源的MSCs均呈成纤維样贴壁生长,细胞倍增时间约为43h,流式细胞术检测大部分细胞处于静止期（＞90%）,只有少部分细胞处于分裂期（＜10%）。MSCs表达CD73、CD90,而CD34、CD45、CD133、HLA-DR均为阴性。MSCs在相应的诱导条件下可以向骨、脂肪分化。PV来源的MSCs染色体检测均为正常核型,其JAK2V617F点突变均为阴性。PV患者的MSCs表达β2-μG、SCF、Flt3配体、TPO、LIF、IL-6、IL-11;不表达GM-CSF、G-CSF、IL-3,与正常人的一致。结论:该细胞群体表现为正常人MSCs的生物学特性。第三部分大鼠骨髓间充质干细胞体外培养过程中老化的研究目的:MSCs因其多向分化潜能和免疫调节功能在再生医学和临床移植中被广泛研究,需要在体外大量扩增。已有人关注到人MSCs在体外扩增的过程中会渐渐老化。关于大鼠MSCs在体外扩增过程中老化过程的研究未见报道。我们将大鼠骨髓MSCs在体外扩增、传代,观察有无老化现象。方法:全骨髓培养法接种大鼠骨髓细胞,贴壁培养获得骨髓间充质干细胞,成骨和成脂肪培养鉴定。在传代过程中,对每代细胞进行测定。瑞氏染色观察其形态,扫描电镜测定其超微结构,CCK-8试剂测定其生长曲线,成骨培养及vos kossa染色,成脂肪培养及油红O染色,以及衰老相关性β-半乳糖苷酶染色和P16ink4a基因定量测定。结果:大鼠骨髓单个核细胞经贴壁培养获得的细胞呈梭型或多角型,有成脂肪和成骨分化能力。细胞瑞氏染色示细胞在传代后渐趋肥大,相差显微镜显示细胞传代后渐趋扁平。超微结构显示2代细胞有20%有内质网轻度扩张和少量线粒体髓鞘样变;4代细胞均呈线粒体髓鞘样变和空泡化。细胞在6代以前增殖旺盛,6代以后生长变缓,8～9代以后细胞几乎不见生长。细胞衰老相关性β-半乳糖苷酶染色阳性率和P16ink4a基因表达量随细胞传代逐渐增加。成脂肪培养显示细胞自6代以后成脂肪能力减弱。成骨培养显示细胞自6代以后成骨能力减弱,且成骨培养中的脂肪化现象增多。结论:大鼠骨髓间充质干细胞在体外培养的过程中逐渐老化,增殖能力和分化能力减弱,形态渐趋扁平肥大。在应用体外扩增后MSCs进行研究时需考虑细胞老化的状态。
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