检测NDV诱导特异性IFN-γ、IL-4的ELISPOT试验方法建立及应用

论文摘要

在病毒免疫过程中,不仅需要体液免疫,而且需要细胞免疫。如在新城疫的免疫方面,细胞免疫与体液免疫协同发挥作用。Ghumman（1976）等发现,接种新城疫活苗和灭活苗后2-3天,就能检测到淋巴细胞内DNA合成增加。Agrawal（1991）等用白细胞游走抑制试验来评价接种ND疫苗后细胞免疫反应,发现接种后确实存在细胞免疫反应。机体针对新城疫的细胞免疫和体液免疫之间究竟是怎么变化的呢?为什么经常出现免疫失败呢?这些问题没有明确的答案。酶联免疫斑点检测技术（ELISPOT）结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术（ELISA）的长处,能够分析经特异抗原活化后分泌细胞因子（如IFN-γ、TNF-α等）的单个效应细胞的频数,具有敏感、特异、易于重复的优点。本研究将ELISPOT技术应用于新城疫细胞免疫的研究,通过对脾淋巴细胞浓度,培养时间,抗原刺激量进行选择,建立了检测NDV诱导特异性IFN-γ、IL-4的ELISPOT方法。结果显示,试验的特异性与培养时间和刺激抗原密切相关,在一定范围内,培养时间越长、刺激抗原越多,试验的特异性越低,当抗原量为5ug/孔,培养时间为7h时,试验的特异性最强。ELISPOT斑点数,随细胞浓度的增加而增加,当小鼠的脾淋巴细胞浓度为106/孔时,最有利于斑点的计数,试验误差最小。用建立的ELISPOT方法对NDV免疫小鼠的IFN-γ、Il-4水平进行检测发现,IFN-γ、Il-4与血清抗体的产生存在着一定的时差关系,在血清抗体阳性检出的前期,IFN-γ的分泌降至最低水平,Il-4升至最高水平。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 引言
• 1 ELISPOT 技术的发展历史
• 2 ELISPOT 的基本原理
• 3 ELISPOT 与其他免疫检测技术的比较
• 4 ELISPOT 技术标准化与验证
• 5 ELISPOT 在动物免疫研究中的应用
• 6 NDV 的生物学特性
• 7 NDV 致病性的分子基础
• 8 新城疫免疫机制
• 9 存在的主要问题
• 10 本研究的目的和意义
• 试验一 检测NDV 诱导特异性IFN-γ的ELISPOT 试验方法建立
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 NDV 浓缩抗原的制备
• 1.2.2 NDV 浓缩抗原蛋白含量测定
• 1.2.3 小鼠的免疫
• 1.2.4 ELISPOT 基本操作步
• 1.2.5 细胞培养时间的选择
• 1.2.6 细胞浓度的选择
• 1.2.7 抗原刺激量的选择
• 2 结果
• 2.1 ELISPOT 试验结果比照
• 2.2 标准曲线的建立和蛋白含量的确定
• 2.3 培养时间的确定
• 2.4 细胞浓度的确定
• 2.5 抗原刺激量的确定
• 3 讨论
• 3.1 细胞状态
• 3.2 内毒素
• 3.3 刺激物
• 3.4 ELISPOT 记数
• 试验二 NDV 诱导特异性IFN-γ、Il-4血清抗体的检测
• 1 试剂和方法
• 1.1 试剂
• 1.1.1 ELISA 主要试剂
• 1.1.2 ELISPOT 主要试剂
• 1.1.3 主要试剂的准备和配制
• 2 方法
• 2.1 免疫方法
• 2.2 ELISA 检测血清抗体
• 2.3 间接ELISA 法检测NDV 抗体最佳工作浓度的确定
• 2.4 间接ELISA 法检测抗NDV 抗体
• 2.5 ELISPOT 基本操作步骤
• 3 结果
• 3.1 间接ELISA 法检测NDV 抗体最佳工作浓度的确定结果
• 3.2 NDV 在小鼠体内诱导抗体的检测
• 3.3 NDV 在小鼠体内诱导IFN-γ、Il-4 的检测
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附图
• 致谢
• 就读硕士期间发表的主要论文
• 个人简介