砂梨上苹果茎痘病毒的分离鉴定及其cp基因遗传转化烟草研究

论文摘要

梨在世界果品产业中占有重要的经济地位。苹果茎痘病毒（Apple stem pittingvirus，ASPV）在我国发生普遍，该病毒危害可导致梨的产量明显下降和品质降低。对ASPV的防治措施主要是栽培无病毒苗木和选育抗病毒品种。近年来利用基因工程技术导入病毒外壳蛋白（cp）基因，培育抗病毒新品种的策略，为该病害的防治开辟了新的途径。本研究采用生物学和分子生物学方法，对我国砂梨（Pyrus pyrifolia）上发生的ASPV进行了分离鉴定；构建了ASPV cp基因的植物表达载体，利用根癌农杆菌EHA105介导的叶盘法进行了转化烟草研究，在国内首次得到了转化ASPV cp基因的西方烟（Nicotiana occidentalis）植株，为进一步利用此策略进行抗病毒育种研究奠定了技术基础。取得的主要研究结果如下：（1）砂梨上ASPV的鉴定和分离。以采集的52份砂梨样品（采自湖北省农科院果树桑蚕研究所国家砂梨种质资源圃）为材料，采用试管捕捉反转录-聚合酶链式反应（TC-RT-PCR）方法对ASPV进行检测，其中33份样品能扩增出316 bp的目标条带，样品带毒率为63.5％。取其中19份感染ASPV的砂梨样品和10份本实验室温室保存的带毒砂梨样品，采用汁液摩擦接种的方法，接种ASPV草本指示植物西方烟。从果茶所采集的19份阳性样品中有9份在西方烟上表现症状，实验室保存的10份带病毒样品在指示植物上全部表现出症状，且均采用TC-RT-PCR方法进行了验证。上述19份感染ASPV的砂梨样品，在西方烟上的症状表现主要有：接种叶片上出现白色坏死斑点；接种叶片上产生黑色斑点，并沿叶脉坏死；接种叶片出现褪绿斑；叶脉黄化等。此外，有少数带病毒样品接种西方烟后不表现明显症状。（2）ASPV cp基因植物表达载体的构建及转化烟草研究。对来源于ASPV分离物6-1-13的cp基因进行克隆与序列测定，将完整的ASPV cp基因克隆到植物表达载体pCAMBIA1301，转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，经过PCR和双酶切筛选阳性克隆，成功构建了ASPV cp基因植物表达载体。将重组质粒转化根癌农杆菌EHA105感受态细胞，运用叶盘法转化5-6叶期的健康西方烟叶片。通过对转化烟草的遗传转化体系的优化，筛选出了适宜的潮霉素浓度、根癌农杆菌菌液浓度及合适的浸染时间。提取分化西方烟植株的总DNA，利用ASPV cp基因的特异引物进行PCR鉴定，结果表明有88株西方烟植株能成功扩增出目标片段，其中转ASPV cp基因正义链的烟草植株68株，转cp基因反义链的烟草植株20株，表明ASPV cp基因已成功导入烟草植株。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1. 苹果茎痘病毒（ASPV）
• 1.1 ASPV的发现
• 1.2 生物学特性
• 1.3 分子生物学特性
• 1.4 检测技术
• 1.4.1 指示植物法
• 1.4.2 血清学检测
• 1.4.3 分子生物学检测
• 1.5 国内研究现状
• 1.6 防治对策
• 2 cp基因抗病毒基因工程的研究进展
• 2.1 cp基因抗病毒基因工程的应用
• 2.2 cp基因介导抗性机制
• 3 反义RNA技术
• 3.1 反义RNA技术作用原理
• 3.2 反义RNA技术在植物基因工程中的应用
• 4 植物转基因研究
• 4.1 植物遗传转化的发展
• 4.2 根癌农杆菌介导的植物转基因
• 4.2.1 根癌农杆菌的研究简史
• 4.2.2 根癌农杆菌的生物学特性
• 4.2.3 根癌农杆菌Ti质粒的结构与功能
• 4.2.4 根癌农杆菌Ti质粒介导的整合转化程序的特点
• 4.2.5 根癌农杆菌转化的机理
• 4.2.6 根癌农杆菌T-DNA转移的影响因素
• 4.2.7 转化细胞的选择培养和再生
• 5. 目的及意义
• 第二章 砂梨上苹果茎痘病毒的分离鉴定
• 1 ASPV分子生物学检测
• 1.1 主要试剂
• 1.2 材料与方法
• 1.2.1 待检样品
• 1.2.2 引物设计
• 1.2.3 样品提取缓冲液
• 1.2.4 试管捕捉RT-PCR（TC-RT-PCR）
• 1.2.5 PCR扩增
• 1.2.6 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）的制备及染色
• 1.3 结果与分析
• 1.3.1 TC-RT-PCR检测
• 2 砂梨上ASPV的分离
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 供试样品
• 2.1.2 指示植物
• 2.1.3 接种缓冲液
• 2.1.4 汁液摩擦接种及带毒叶片的保存
• 2.2 结果与分析
• 3 结论与讨论
• 第三章 ASPV的cp基因植物表达载体构建及转化烟草研究
• 1 前言
• 2 cp基因的克隆与序列测定
• 2.1 主要试剂
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 供试材料
• 2.2.2 引物设计
• 2.2.3 cp基因的PCR扩增与检测
• 2.2.4 目标片段的回收与纯化
• 2.2.5 目标片段与载体的连接
• 2.2.6 连接产物转化宿主菌
• 2.2.6.1 大肠杆菌DH10B感受态细胞的制备
• 2.2.6.2 热击转化大肠杆菌DH10B感受态细胞
• 2.2.7 阳性克隆的筛选
• 2.2.8 质粒DNA的制备
• 2.2.9 重组质粒的鉴定
• 2.2.9.1 PCR鉴定
• 2.2.9.2 酶切鉴定
• 2.2.10 序列测定和分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 cp基因的PCR扩增
• 2.3.2 重组质粒的PCR检测和酶切鉴定
• 2.3.3 ASPV cp基因的序列分析
• 3 cp基因植物表达载体的构建
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 供试材料
• 3.1.2 质粒pCAMBIA1301S的提取、酶切与纯化
• 3.1.3 质粒PMD18-T-CP的酶切与纯化
• 3.1.4 目标片段与载体的连接与转化
• 3.1.5 重组质粒的鉴定
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 重组植物表达载体的PCR和酶切鉴定
• 4 叶盘法转化西方烟
• 4.1 主要试剂
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 供试材料
• 4.2.2 根癌农杆菌感受态细胞的制备
• 4.2.3 重组植物表达载体转化根癌农杆菌感受态细胞
• 4.2.4 烟草的转化、再生和筛选
• 4.2.5 选择压力的确定
• 4.2.6 遗传转化体系的优化
• 4.2.7 Hyb抗性植株的筛选及PCR检测
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 外植体对潮霉素的敏感性
• 4.3.2 根癌农杆菌菌液浓度对外植体侵染的影响
• 4.3.3 不同浸染时间对根癌农杆菌侵染力的影响
• 4.3.4 Hyb抗性烟草植株的获得
• 4.3.5 Hyb抗性植株的PCR检测
• 4.4 结论与讨论
• 附录 试验常用溶液配方
• 参考文献
• 致谢