论文摘要
血管生成是肿瘤生长和转移的必要条件。肿瘤血管抑制疗法已成为目前肿瘤治疗研究领域的热点。采用肿瘤血管抑制疗法,关键是提高肿瘤血管内皮的靶向性。研究表明,不同组织的血管具有异质性;肿瘤血管也特异性表达正常血管不表达或痕量级表达的异质性分子,而这些分子可作为研究治疗的靶点。活体噬菌体肽库筛选技术为我们筛选出选择性结合于特定血管靶向受体的小肽提供了一项技术手段。通过活体噬菌体筛选技术,已发现多种肿瘤血管内皮特异性结合肽。如:RGD-4C、NGR、CPRECES、GSL基序。GX1是我们利用随机噬菌体环7肽库,从人胃低分化腺癌的小鼠肾包膜下异种移植瘤模型体内筛选出来的能够与人胃癌血管内皮细胞特异性结合的环状9肽。在前期工作中,我们对GX1进行了初步体外鉴定。免疫组化结果显示,GX1噬菌体能够与人胃癌、结肠癌组织及荷瘤小鼠移植瘤内的血管特异性结合。GX1受体在胃癌中的表达与其恶性程度相关,在低分化胃癌组织中的表达明显高于高分化和中分化胃癌组织。GX1噬菌体与人脐静脉内皮细胞的结合力强于其他肿瘤细胞。分子模拟显示其空间结构相对稳定,可作为抗原结合表位。目前,该小肽序列已取得国家发明专利。体外鉴定结果显示GX1噬菌体能够与胃癌、结肠癌内血管特异性结合。为进一步评价GX1在肿瘤血管导向治疗中的应用价值,需要对GX1噬菌体表面呈现肽CGNSNPKSC进行进一步体内外鉴定;而一个新型的噬菌体淘筛小肽是否可作为生物导向分子用于肿瘤血管抑制治疗导向性药物的开发,主要取决于三要素:小肽与内皮细胞结合的特异性、与其受体结合的亲和力及活体内的肿瘤血管靶向性。本课题将对此三方面进行探讨。【目的】1.利用放射性核素标记GX1短肽,用放射自显影、体外受体放射配基结合分析,结合噬菌体体外结合实验进一步鉴定GX1与内皮细胞结合的特异性,与其受体结合的亲和力;分析GX1与共培养及单纯培养内皮细胞结合的差异,评价GX1是否为肿瘤血管内皮所特异性结合分子。2.利用活体示踪技术,将标记肽注入荷瘤小鼠体内,研究GX1在体内的代谢、分布;从活体水平,利用影像学方法鉴定GX1是否具有肿瘤血管的靶向性。【方法】1.化学合成GX1,采用直接标记法,利用99TcmO4-标记GX1。标记产物进行质量鉴定,包括放化纯度、比活度测定及稳定性分析。分离、培养人脐静脉内皮细胞,利用微观放射自显影术对99Tcm-GX1进行生物学活性鉴定。2.利用微观放射自显影术、体外受体放射配基结合分析及竞争抑制分析,结合噬菌体体外结合实验进一步分析GX1与内皮细胞结合的特异性、与其受体结合的亲和力及受体密度;构建共培养脐静脉内皮细胞,分析GX1与共培养脐静脉内皮细胞及单纯培养的脐静脉内皮细胞亲和性的差异。3.构建荷人胃癌移植瘤裸鼠模型,将99Tcm-GX1尾静脉注入荷瘤小鼠体内,进行生物学分布研究,验证标记肽是否具有肿瘤组织的特异性分布特性。4.将99Tcm-GX1尾静脉注入荷瘤小鼠体内,进行ECT显像,观察标记肽是否具有肿瘤血管靶向性。【结果】1. （1）99Tcm直接法标记GX1,所得标记率在90-98%,比活度大于200Ci/mmol;将99Tcm-GX1室温下放置,以及与生理盐水、血清、EDTA、半胱氨酸混合, 0-24h各溶液中标记率维持在97-88%,无明显降低,说明99Tcm-GX1具有良好的体内外稳定性。（2）受体放射自显影术显示99Tcm-GX1能够与人脐静脉内皮细胞结合,具有良好的生物学活性。2.微观放射自显影、体外受体放射配基结合分析及竞争抑制分析、噬菌体体外结合实验显示:（1）GX1短肽或噬菌体可特异性与脐静脉内皮细胞结合,与胃癌SGC7901细胞、结肠癌LoVo细胞、永生化胃上皮细胞GES细胞未见明显结合,说明GX1与内皮细胞结合具有特异性。（2）GX1与共培养内皮细胞的结合量要高于单纯培养的内皮细胞。Scatchard作图显示,GX1与共培养及单纯培养的脐静脉内皮细胞结合的Kd值分别为3062pM、3831pM,每个细胞上的结合位点分别为1.17×104/ Co-HUVEC、0.88×104 / HUVEC。3.生物学分布结果显示,标记肽经肾脏代谢,肿瘤组织的放射性高于肌肉、肠、甲状腺和胃组织。在肝脏、脾脏、肺血供丰富的组织及血液,早期也有较高的放射性浓聚,随时间延长,放射性逐渐下降。肿瘤组织的分布0.5h为1.19±0.08% ID/g,24h降为0.74±0.02%ID/g,为肌肉组织的11倍。计算T/NT比值,从0.5到24h,肿瘤与肌肉、血液、肝、肾单位质量的放射性比值呈递增趋势,提示GX1具有肿瘤组织的靶向性特征。4.将99Tcm-GX1尾静脉注入荷瘤小鼠体内,进行ECT显像,连续追踪观察24h,在裸鼠右后肢背侧肿瘤部位可见一放射性浓聚灶,自8h开始,逐渐高于心血池本底,18h显影最清晰,至24h仍可见放射性浓聚影。对照组裸鼠尾静脉注入99Tcm-OXT（催产素）,进行ECT显像,在右后肢背侧肿瘤部位也可见有放射性分布,但其放射性始终低于心血池本底。计算实验组和对照组裸鼠肿瘤部位和心脏部位的放射性比值,实验组自8h开始,比值呈上升趋势,至24h,比值达1.4;对照组比值始终位于1以下。在荷结肠癌小鼠,也可见到肿瘤显影。【结论】1. 99Tcm直接法标记GX1,标记率大于90%,比活度高,体内外稳定性好,具有良好的生物学活性,完全可以满足ECT显像的要求。2. GX1与内皮细胞具有良好的受体结合特异性及亲和力,其亲和常数K d值为3831pM,每个细胞上的结合位点为0.88×104 / HUVEC。3.与单纯培养的内皮细胞相比,GX1与共培养内皮细胞具有更高的受体结合的亲和力及更多的受体结合位点。4. GX1具有肿瘤标志物的影像学特征,良好的体内肿瘤组织的靶向性,为肿瘤血管内皮特异性靶向肽。