四种海藻热休克蛋白70（HSP70）基因的克隆与表达分析

论文摘要

热休克蛋白70是热休克蛋白家族中重要的成员,参与新生蛋白的折叠、转运、重折叠变性蛋白、协助降解变性蛋白和抗逆环境胁迫等功能。海带和裙带菜是浅海潮下带典型的褐藻,孔石莼和浒苔是潮间带典型的绿藻,四种大型海藻均有重要的经济价值和生态价值。随着潮汐变化固着藻类生境理化因素变化剧烈,藻类面临着严重的环境胁迫,因此研究藻类抗逆机理有着重要的意义。本研究采用同源克隆法配合RACE-PCR,克隆了海带、孔石莼、裙带菜和浒苔HSP70基因的全序列（分别命名为LJHSP70、UPHSP70、QDHSP70和EPHSP70）。利用生物信息学方法分析了四种藻类HSP70结构特征、同源性关系和进化地位。获得的海带HSP70基因全序列长为2918 bp,5’非翻译区为248 bp,3’非翻译区为696 bp,开放阅读框为1974 bp,编码657个氨基酸,预测的分子量为72.03 kDa,等电点为4.97。获得的裙带菜HSP70基因全序列长为3243 bp,5’非翻译区为248 bp,3’非翻译区为1021 bp,开放阅读框为1974 bp,编码657个氨基酸,预测的分子量为72.03 kDa,等电点为4.96。获得的孔石莼HSP70基因全序列长为2283 bp,5’非翻译区为65 bp,3’非翻译区为247 bp,开放阅读框为1971 bp,编码656个氨基酸,预测的分子量为71.13 kDa,等电点为5.04。获得的浒苔HSP70基因全序列长为2265 bp,5’非翻译区为65 bp,3’非翻译区为217 bp,开放阅读框为1983 bp,编码660个氨基酸,预测的分子量为71.39 kDa,等电点为5.03。四种海藻HSP70氨基酸序列均含有四肽重复序列GGMP,具有三个典型的HSP70签名基序。细胞质定位的HSP70 C-末端特征基序为EEID或EEVD,并且N-端氨基酸序列保守性高于C-端。海带和裙带菜HSP70蛋白同源性为98%,孔石莼和浒苔HSP70蛋白同源性为96%,四种海藻HSP70蛋白序列与陆地植物和其他藻类HSP70蛋白序列同源性为70-80%。利用荧光定量RT-PCR技术对不同胁迫条件处理的海带和孔石莼HSP70 mRNA的表达水平进行定量分析。不同热激温度（5-40℃）处理组中,30℃处理组的海带HSP70 mRNA表达量最高是10℃处理组的海带HSP70 mRNA表达量的3倍,而35℃或40℃处理组的海带HSP70表达量却低于25℃或30℃处理组的海带HSP70 mRNA表达量。25℃不同热激时间（0-12 h）处理组中,海带HSP70 mRNA表达量呈先上升后下降趋势。热激1 h后海带HSP70 mRNA表达量迅速上升,热激7 h后mRNA表达量达到最大,是对照组表达量的4倍。不同盐度（0‰-45‰）胁迫处理组中,0‰或5‰盐度处理组的海带HSP70 mRNA表达量是30‰盐度处理组海带HSP70 mRNA表达量的3倍。35‰、40‰和45‰盐度处理组之间HSP70 mRNA表达量较低且无显著差异。不同热激温度（5-40℃）处理组中,20℃或25℃处理的孔石莼HSP70 mRNA表达量较低,而5℃、35℃、或40℃处理组的孔石莼HSP70 mRNA的表达量是25℃处理组孔石莼HSP70 mRNA表达量的2倍以上。30℃不同热激时间（0-12 h）处理组中,孔石莼HSP70 mRNA表达量也呈先上升后下降趋势。热激5 h后孔石莼HSP70 mRNA表达量达到最大,是对照组的3.5倍。不同盐度（0‰-45‰）胁迫处理组中,0‰或5‰盐度处理组的孔石莼HSP70 mRNA表达量是30‰盐度处理组孔石莼HSP70表达量的3倍。30‰、40‰和45‰盐度处理组孔石莼HSP70 mRNA表达量较低,且无显著差异。不同紫外线照射时间（0-4.0 h）和不同干燥时间（0-4.0 h）处理组中,孔石莼HSP70 mRNA表达量都在3 h后达到最高值,之后表达量维持在较高水平。为进一步研究藻类HSP70的生物学功能,将海带HSP70基因的开放阅读框区域克隆到表达载体pEASY-E2中,并转化到大肠杆菌BL21（DE3）pLysS。将阳性重组子培养于含有AMP（100 U/mL）的LB培养基,IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳鉴定。经5 h诱导,其表达量达到平台期,继续培养HSP70表达量并不显著增高。5 mM IPTG诱导海带HSP70蛋白表达量高于1 mM IPTG诱导蛋白表达量。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1. 植物抗逆分子机制及其研究进展
• 1.1 渗透调节物质的合成与积累
• 1.2 抗逆相关蛋白质的合成
• 1.3 植物对逆境胁迫信号的传导途径
• 1.4 植物逆境胁迫应答的基因表达调控
• 2. 热休克蛋白研究进展与意义
• 2.1 热休克蛋白的特性
• 2.2 热休克蛋白的分类与分布
• 2.3 热休克蛋白的分子结构
• 2.4 热休克蛋白的表达与调控
• 2.5 热休克蛋白的功能及研究意义
• 3. 藻类抗逆机理和HSP 的研究进展
• 4. 本研究目的及意义
• 第二章 四种海藻热休克蛋白70 基因的克隆与分析
• 1. 材料和方法
• 1.1 实验材料与仪器试剂
• 1.2 RNA 的提取和cDNA 合成
• 1.3 海藻HSP70 目的片段的克隆
• 1.4 感受态细胞的制备、目的片段连接和转化
• 1.5 RACE 扩增海藻HSP70 全序列
• 1.6 海藻HSP70 的生物信息学分析
• 2. 结果与分析
• 2.1 海藻总RNA 的提取
• 2.2 海带HSP70 基因的克隆
• 2.3 裙带菜HSP70 基因的克隆
• 2.4 孔石莼HSP70 基因的克隆
• 2.5 浒苔HSP70 基因的克隆
• 2.6 海藻HSP70 基因序列分析
• 2.7 海藻HSP70 蛋白疏水性分析
• 2.8 海藻HSP70 空间结构预测
• 2.9 HSP70 同源性分析
• 2.10 HSP70 系统发生进化分析
• 3. 讨论与小结
• 3.1 海藻RNA 的提取
• 3.2 海藻HSP70 基因的克隆
• 3.3 海藻HSP70 基因序列分析
• 第三章 海带和孔石莼热休克蛋白70 m RNA 表达水平研究
• 1. 材料与方法
• 1.1 实验材料与仪器试剂
• 1.2 海藻RNA 提取及质量检测
• 1.3 定量PCR 引物的设计和cDNA 合成
• 1.4 定量PCR 检测HSP70 mRNA 表达水平
• 1.5 数据处理和分析
• 2. 结果与分析
• 2.1 海带和孔石莼总RNA 的提取
• 2.2 海带和孔石莼HSP70 cDNA 梯度稀释实验
• 2.3 海带HSP70 m RNA 表达定量分析
• 2.4 孔石莼HSP70 m RNA 表达定量分析
• 3. 讨论与小结
• 3.1 mRNA 定量表达分析
• 3.2 海藻HSP705 的抗逆作用研究
• 3.3 海藻HSP705 m RNA 表达水平
• 第四章 海带热休克蛋白70 基因体外表达的研究
• 1. 材料和方法
• 1.1 实验材料与仪器试剂
• 1.2 海带HSP70 基因ORF 的克隆
• 1.3 HSP70 表达质粒的构建和鉴定
• 1.4 海带HSP70 的体外表达和电泳检测
• 2. 结果与分析
• 2.1 PCR 扩增海带HSP70 的ORF
• 2.2 HSP70 表达质粒的鉴定
• 2.3 海带HSP70 基因体外表达
• 3. 讨论与小结
• 结论和创新点
• 参考文献
• 发表文章目录
• 致谢