论文摘要
炭疽是严重威胁人类健康的传染性疾病，接种炭疽疫苗是预防炭疽的有效手段，但是疫苗产生保护性免疫需要一定时间，在疾病流行和某些突发事件发生时无法提供有效的紧急免疫防护。而中和性抗体作为被动免疫制剂可以弥补炭疽疫苗的不足，直接提供有效的保护。因此，本研究选择在中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）细胞中表达具有中和活性的抗炭疽芽胞杆菌重组保护性抗原（recombinant protective antigen，rPA）的嵌合抗体，为炭疽的治疗提供被动免疫制剂。首先克隆3株具有中和活性的抗炭疽芽胞杆菌重组保护性抗原（rPA）的鼠源单克隆抗体（monoclonal antibody，nAb）的VL和VH基因。对获得的可变区基因序列进行生物信息学的分析，初步判断为鼠的免疫球蛋白（Immunoglobin，Ig）基因。为了快速验证获得的可变区基因是否具有生物学活性，将5E1和4B2的VL、VH基因分别通过（Gly4Ser）3的连接肽融合构建了scFv基因，在大肠杆菌中表达并纯化了单链抗体，实验表明scFv能够与rPA特异结合，且在细胞模型上具有中和活性，为表达具有中和活性的嵌合抗体奠定了实验基础。为表达全分子嵌合抗体，通过重叠延伸PCR技术将5E1的VH、VL基因分别与人IgG1亚类的CH和CK基因融合，构建了完整人-鼠嵌合抗体基因。将人-鼠嵌合抗体基因克隆到表达载体的多克隆位点（mutiple cloning site，MCS），构建了嵌合抗体的表达质粒。将构建的表达质粒转染CHO／dhfr-（DG44）细胞，经氨甲喋呤（Methotrexate，MTX）初步加压(MTX浓度为5×10-8mol／L)筛选，获得最高表达量为18mg／L的细胞株。对此细胞株扩大培养并纯化嵌合抗体。纯化的嵌合抗体在非还原SDS-PAGE中表现为一条约150kD的带，在还原SDS-PAGE中表现为一条约50kD和一条约25kD的带；Western印迹结果显示，全分子蛋白和重链（heavy chain，H链）分子均可与羊抗人IgG Fc发生特异性免疫反应；全分子蛋白和还原后的轻链（light chain，L链）重链（high chain，H链）分子均可与羊抗人IgG发生特异性免疫反应。ELISA检测结果显示，纯化的嵌合抗体与rPA发生反应，说明表达的嵌合抗体保留了亲本鼠源mAb的抗原结合活性。在毒素作用的J774A．1细胞模型和Fisher 344大鼠模型上，纯化的嵌合抗体表现出与鼠源mAb 5E1大致相同的中和活性。以上实验结果表明，制备的嵌合抗体能作为被动保护制剂，在炭疽的治疗上具有潜在应用价值。