钙激活性氯离子通道在低氧大鼠肺动脉平滑肌中的作用及其机制的研究

论文摘要

研究背景 目前，肺动脉高压和肺心病的发病率仍然居高不下。低氧性肺动脉高压（hypoxic pulmonary hypertension，HPH）是最常见的类型，其发病机制目前尚不十分清楚，低氧性肺血管收缩（hypoxic pulmonary vasoconstriction，HPV）和低氧性肺血管重建（hypoxic pulmonary vascular remodeling）是其两大病理生理基础。目前认为，低氧引起的肺血管收缩并非完全依赖于血管内皮细胞，血管平滑肌细胞也可介导血管收缩反应。在影响血管张力的各种因素中，离子通道在其中的作用是研究热点。本实验室已有的研究发现血管平滑肌细胞钾通道发挥着一定的作用。但用钾通道开放剂并不能阻止HPV的发生，故氯通道越来越为国内外学者所关注。研究发现氯通道与原发性高血压密切相关，但氯通道在肺动脉高压中是否起作用目前尚不清楚。 肺动脉平滑肌细胞（pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs）膜主要有两种氯离子通道：钙激活性氯离子(Ca2+-activated Cl-，ClCa))通道和容量敏感性氯离子(volume-sensitive Cl-，Clswell)通道。尼氟灭酸（Niflumic acid，NFA）、和indaryloxyacetic acid（IAA-94）是ClCa通道特异性阻滞剂，且细胞浆内游离钙离子浓度(cytoplasmic free Ca2+concentration，[Ca2+]i)升高是激活ClCa通道的必要条件。研究已证实，生理条件下ClCa通道参与了血管活性药诱导的肿动脉平滑肌细胞膜去极化和肺动脉收缩。大量研究表明急性或慢性低氧均引起PASMCs[Ca2+]i升高，而[Ca2+]i的升高又是激活ClCa通道的必要条件，那么低氧是否激活ClCa通道呢?用氰化物模仿低氧环境可以在鼠的PASMCs引起[Ca2+]i升高和激活钙激活性氯离子电流(Ca2+-activated Cl-currents，ICl（Ca）)，但在真实低氧环境中[Ca2+]i与ClCa通道的关系国内外尚未见报道。目前，ClCa通道是否参与低氧性肺血管收缩和重建尚不清楚。 低氧时[Ca2+]i的升高是来自细胞外Ca2+通过细胞膜钙通道内流还是来自细胞内钙库的Ca2+释放或二者均参与目前国内外还存在争议，低氧首先触发外Ca2+内流呢还是细胞内钙库的Ca2+释放呢?如果是细胞内钙库的Ca2+释放，来自细胞内库存的Ca2+是由理阿诺碱受体敏感（ryanodine receptor-seneitive）钙库还是IP3受体敏感钙库(IP3 receptor-seneitive Ca2+store)的钙释放呢?二者关系如何?上述问题国外有少量报道且研究结果不一致。ClCa通道如果参与了低氧性肺血管收缩和重建，那么钙信号在其中又是如何作用的呢?基于此，本研究通过模拟生理、急性和慢性低氧环境，利用免疫组织化学技术、膜片钳技术，荧光光度法检测细胞内钙等多种实验方法，探讨ClCa通道在低氧性肺血管收缩和重建中的作用及其作用机制，为HPH的发病机制研究和防治提供实验资料。 第一部分 生理条件下钙激活性氯离子通道在大鼠肺动脉张力中的调节作用及其机制 分题一 生理条件下肺动脉平滑肌细胞膜钙激活性氯离子通道的电生理特性及意义 目的：观察生理条件下肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）膜钙激活性氯离子通道(ClCa)的电生理特性，并探讨其意义。 方法：大鼠单个PASMCs获得采用急性酶分离法（胶原酶I型和木瓜蛋白酶）。分别通过含Ca2+及无Ca2+的细胞外液、苯福林（PE）和环匹阿尼酸（CPA）等引起细胞浆内游离钙离子浓度([Ca2+]i)变化，用全细胞膜片钳技术测定PASMCs钙激活氯电流(ICl（Ca）)的改变。 结果：（1）PE和CPA等均可引起[Ca2+]i升高，由（88.24±4.89）nmol／L升高到（246.73±13.95）nmol／L（P＜0.01）。（2）[Ca2+]i升高可以引出ICl（Ca），ClCa通道阻滞剂尼氟火酸（NFA）和indaryloxyacetic acid（IAA-94）均可可逆性的抑制此电流，由（-241.3±59.7）pA，到（-96.7±24.3）pA，（P＜0.01）。 结论：生理条件下大鼠PASMCs具有ClCa通道；细胞外Ca2+内流及细胞浆内Ca2+释放均可激活该通道，其参与了血管活性药诱导的肿动脉收缩。 分题二 生理条件下钙激活性氯离子通道对大鼠肺动脉张力的调节作用 目的：研究钙激活性氯离子通道及其通道阻滞剂尼氟灭酸（Niflumic acid，NFA）和indaryloxyacetic acid（IAA-94）在苯福林（phenylephrine，PE）引起的肺动脉收缩中的作用。 方法：常规离体血管灌流法检测肺动脉环张力；采用钙荧光探针（Fura-2／AM）负载急性酶分离法（胶原酶I型和木瓜蛋白酶）获得的大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMCs），观察NFA和IAA-94对PE诱导的PASMCs胞浆游离钙离子浓度([Ca2+]i)的影响，用荧光分光光度计法检测[Ca2+]i。 结果：钙激活性氯离子通道阻滞剂NFA和IAA-94可以舒张PE引起的肺动脉环收缩，舒张率分别达（89.9±3.7）％和（70.7±10.4）％（P＜0.01）；NFA和IAA-94对KCl引起的血管收缩无影响；PE可以引起[Ca2+]i升高，由（88.24±4.89）nmol／L到（243.83±5.30）nmol／L（P＜0.01），NFA和IAA-94使升高的[Ca2+]i降低，由（243.83±5.30）nmol／L到（84.58±5.15）nmol／L（P＜0.01）。 结论：钙激活性氯离子通道在生理状态下与血管活性药（PE）引起的肺动脉张力变化有关，这为研究其在低氧性肺血管收缩中的作用提供了新的线索。 第二部分 急性低氧时钙激活性氯离子通道在大鼠肺动脉舒缩中的作用及机制 分题一 急性低氧时钙激活性氯离子通道在大鼠肺动脉舒缩中的作用目的：观察大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）膜钙激活性氯离子(ClCa)通道在急性低氧性肺血管收缩（HPV）中的作用。 方法：常规离体血管灌流法检测急性低氧时肺动脉环张力变化；钙荧光探针（Fura-2／AM）负载培养PASMCs，观察常氧（37℃、5％CO2、21％O2、74％N2）和急性低氧（37℃、5％CO2、2％O2、93％N2）条件下[Ca2+]i的变化；观察ClCa通道阻滞剂尼氟灭酸（NFA）和indaryloxyacetic acid（IAA-94）对肺动脉张力和[Ca2+]i的影响。 结果：（1）常氧对肺动脉环张力无影响，急性低氧使肺动脉环收缩。ClCa通道阻滞剂NFA和IAA-94可以舒张急性低氧引起的肺动脉环收缩，其舒张率分别达（52.2±19.2）％和（30.6±8.6）％（P＜0.01）；（2）急性低氧时[Ca2+]i升高：常氧状态下，PASMCs[Ca2+]i为（95.73±19.61）nmol／L，低氧时为（247.50±22.15）nmol／L（P＜0.01）；（3）常氧时，NFA和IAA-94对[Ca2+]i无影响（P＞0.05）；低氧时，NFA和IAA-94使PASMCs[Ca2+]i由（247.50±22.15）nmol／L降低到（126.19±11.10）nmol／L（P＜0.01）。 结论：急性低氧引起[Ca2+]i升高，这可能激活ClCa通道，对[Ca2+]i起正反馈作用，ClCa通道可能在低氧性肺血管收缩中起作用。 分题二：急性低氧时大鼠肺动脉平滑肌细胞内钙信号水平的变化及意义 目的：观察急性低氧对大鼠肺动脉平滑肌内质网游离钙离子水平的影响。 方法：细胞水平：通过钙荧光探针（Fura-2／AM）负载大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMCs），用荧光分光光度法，在细胞外液无Ca2+的条件下，分别给予常氧（37℃、5％CO2、21％O2、74％N2）和急性低氧（37℃、5％CO2、2％O2、93％N2）气体，通过理阿诺碱（RD）和环匹阿尼酸（CPA）等工具药检测大鼠PASMCs细胞浆内游离钙离子浓度([Ca2+]i)的变化；离体血管环水平：血管环在无Ca2+的液体灌流下，给予上述条件，运用离体血管灌流方法检测肺动脉环张力变化。结果：（1）急性低氧时[Ca2+]i升高：常氧组PASMCs[Ca2+]i为（96.99±7.16）nmol／L，低氧组为（257.06±32.48）nmol／L（P＜0.01）。（2）与低氧组比较，预先用RD或咖啡因耗竭内质网理阿诺碱受体敏感钙库，随后再给予低氧刺激时[Ca2+]i不升高，为（108.71±10.38）nmo]／L左右（P＜0.01）；而用CPA或thapsigargin（TG）耗竭内质网IP3受体敏感钙库，随后再给予低氧刺激时[Ca2+]i仍呈升高状态（P＞0.05）。（3）低氧引起离体肺动脉环收缩：常氧对基础张力无明显影响，低氧引起肺动脉环收缩，最大收缩张力达（49.28±8.64）mg／mg（P＜0.01）。（4）预先用RD或咖啡因耗竭理阿诺碱受体敏感钙库，随后再给予低氧刺激时，收缩的肺动脉环舒张，舒张率最高达（91.75±5.74）％（P＜0.01）；而用CPA或TG耗竭IP3受体敏感钙库，随后再给予低氧刺激时，对收缩的肺动脉环无明显影响，舒张率最高达（12.1±4.26）％（P＞0.05）。 结论：急性低氧时主要是来自内质网理阿诺碱受体敏感钙库的Ca2+释放参与了低氧性肺血管收缩的发病机理，而IP3受体敏感钙库的Ca2+释放在此无明显作用；这是PASMCs自身具有的，既不依赖细胞外Ca2+经细胞膜钙通道内流，也不依赖血管内皮。 第三部分 慢性低氧时钙激活性氯离子通道在大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖及其相关基因表达中的作用 目的：探讨慢性低氧条件下钙激活性氯离子(ClCa)通道对大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）增殖及其相关基因表达的影响。 方法：将PASMCs分别于常氧（37℃、5％CO2、21％O2、74％N2）及慢性低氧（37℃、5％CO2、2％O2、93％N2）条件下分为4组：（1）对照绀（N：常氧，H：低氧）（Nc，Hc）：（用不含药物的无血清培养基处理）：（2）10 NFA组(N10NFA，H10NFA)：（含10 μmol／L尼氟灭酸（NFA）的无血清培养基处理）：（3）50 NFA组(N50NFA，H50NFA)：（含50 μmol／L NFA的无血清培养基处理）；（4）IAA-94组(NIAA-94，HIAA-94)：（含10 μmol／L indaryloxyacetic acid（IAA-94）的无血清培养基处理）。采用电镜观察低氧对PASMCs形态的影响；流式细胞术观察细胞的周期；应用荧光光度法检测细胞内钙；四甲基偶氮唑盐（MTT）微量比色分析法检测细胞的增殖；免疫细胞化学技术检测增殖细胞核抗原（PCNA）及基因c-fos和c-jun的蛋白表达，以观察ClCa通道阻滞剂对培养的PASMCs增殖的影响。 结果：（1）低氧使PASMCs表型从收缩型向合成型转换，电镜下合成型表现为胞浆内SM-α-actin减少，线粒体和粗面内质网增多；（2）慢性低氧时[Ca2+]i升高：常氧状态下，PASMCs[Ca2+]i为（123.63±18.98）nmol／L，低氧时为（281.75±16.48）nmol／L（P＜0.01）；常氧时，NFA和IAA-94对[Ca2+]i无影响（P＞0.05），慢性低氧时，NFA和IAA-94使PASMCs[Ca2+]i由（281.75±16.48）nmol／L降低到（117.66±15.36）nmol／L（P＜0.01）；（3）MTT比色法中，慢性低氧状态下NFA和IAA-94引起升高的吸光度（A）值降低，由0.459±0.058到0.224±0.025（P＜0.01）；（4）慢性低氧时PCNA表达的阳性率明显增高，与常氧组比较差异有显著性（P＜0.01）；NFA和IAA-94处理组表达的阳性率明显下降，与低氧组比较差异有显著性（P＜0.01）；而NFA和IAA-94对常氧各组的阳性表达率无影响（与常氧对照组比较差异无显著性，P均＞0.05）；（5）流式细胞分析显示慢性低氧时S+G2M期细胞所占比例增高，增殖指数明显增加，与常氧组比较差异有显著性（P＜0.01）；NFA和IAA-94处理组G0G1期所占细胞的比例增加，S+G2M期细胞所占比例减少，增殖指数明显减少，与低氧组比较差异有显著性（P＜0.01）；而NFA和IAA-94对常氧时的各期细胞所占的比例及增殖指数无影响（与常氧对照组比较差异无显著性，P均＞0.05）；（6）图象分析显示，慢性低氧时c-fos和c-jun蛋白阳性染色平均积分光密度值（AIOD）明显增高，与常氧组比较差异有显著性（P＜0.01）；NFA和IAA-94处理组AIOD明显下降，与低氧组比较差异有显著性（P＜0.01）；而NFA和IAA-94对常氧各组的AIOD无影响（与常氧对照组比较差异无显著性，P均＞0.05）。 结论：慢性低氧引起细胞内Ca2+浓度升高，细胞表型改变，促进细胞增殖；低氧条件下抑制ClCa通道的活性可降低细胞内Ca2+浓度，抑制细胞的增殖，提示ClCa通道在低氧肺动脉高压中起作用。

论文目录

• 缩略语
• 中文摘要
• 英文摘要
• 正文
• 第一部分:生理条件下钙激活性氯离子通道在大鼠肺动脉张力中的调节作用及其机制
• 分题一:生理条件下肺动脉平滑肌细胞膜钙激活性氯离子通道的电生理特性及其意义
• 分题二:生理条件下钙激活性氯离子通道对大鼠肺动脉张力的调节作用
• 第二部分:急性低氧时钙激活性氯离子通道在大鼠肺动脉舒缩中的作用及其机制
• 分题一:急性低氧时钙激活性氯离子通道在大鼠肺动脉舒缩中的作用
• 分题二:急性低氧时大鼠肺动脉平滑肌细胞内钙信号水平的变化及其意义
• 第三部分:慢性低氧时钙激活性氯离子通道在大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖及其相关基因表达中的作用
• 小结与展望
• 综述
• 氯离子通道与肺动脉张力
• 平滑肌细胞钙信号转导的研究进展
• 附录
• 博士期间论文发表情况
• 致谢