纤维素酶系中内切β-葡聚糖苷酶的分离纯化及动力学研究

论文摘要

本论文进行了纤维素酶系中内切β-葡聚糖苷酶（内切酶）的分离纯化及内切酶动力学研究。通过（NH4）2SO4盐析、Sephadex G100凝胶柱层析、DEAE FF弱阴离子交换柱层析（应用快速蛋白液相色谱系统FPLC）等分离纯化技术,从市购黑曲霉发酵粉和本实验室自行筛选的一株绿色木霉MJ1固体发酵产物中分离分别纯化出两种电泳纯内切酶。从黑曲霉发酵粉中分离纯化出的内切酶的比活力提高了8.1倍,回收率为7.5%,SDS-PAGE电泳后经凝胶成像系统分析分子量为26.4KD。最适反应温度是55℃,最适pH为4.8,动力学参数Km和Vmax分别为6.838×10-3g·mL-1、2.906×10-2mg·（mL·min）-1。从绿色木霉MJ1固体发酵产物中分离纯化出的内切酶的比活力提高了28.6倍,回收率为19.7%,SDS-PAGE电泳后经凝胶成像系统分析分子量为64.7KD。最适反应温度为53℃,最适pH为4.2,Km和Vmax分别为1.230×10-2g·mL-1、2.396×10-2mg·（mL·min）-1。向黑曲霉产电泳纯内切酶中加入葡萄糖,结果表明葡萄糖增加了内切酶的热稳定性。探讨了葡萄糖对酶活力的保护作用机制,建立了一个动力学模型,并进行了验证。热力学参数熵和焓值的降低也进一步证实了实验结论。在一系列假设基础上提出绿色木霉MJ1产电泳纯内切酶水解CMC-Na的反应机理,建立了一个pH值对内切酶活力影响的动力学模型,推导出反应速率表达式。试验最佳初始pH值与模型计算pH值符合,从而模型得以验证。向绿色木霉MJ1产内切酶液中分别添加葡萄糖、半乳糖、木糖、蔗糖、果糖等几种糖,结果表明:葡萄糖和半乳糖对内切酶具有竞争性抑制作用,而半乳糖的抑制作用更大;木糖对其产生非竞争性抑制;蔗糖起到了反竞争性抑制作用;D-果糖基本无影响。并讨论了葡萄糖、半乳糖、木糖和蔗糖对内切酶的作用机制。用甲醇修饰绿色木霉产内切酶,结果表明:甲醇的修饰导致内切酶活力的显著降低,葡萄糖和底物降低了酶修饰的失活程度,由FTIR分析所修饰的侧链基团为羧基,动力学方法分析确认一个羧基为内切酶活性部位的必需基团。通过对FTIR原始光谱的酰胺Ⅰ带进行二阶导和曲线拟合得出修饰后内切酶二级结构的变化为:β-折叠和α-螺旋的含量均升高,而转角和无序结构含量降低。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 绪论
• 1.1 纤维素酶
• 1.1.1 纤维素酶的来源和组成
• 1.1.2 纤维素酶的作用机制
• 1.1.3 纤维素酶的应用
• 1.1.3.1 能源工业
• 1.1.3.2 食品工业
• 1.1.3.3 造纸工业
• 1.1.3.4 洗涤剂工业
• 1.1.3.5 纺织工业
• 1.1.3.6 饲料工业
• 1.1.3.7 医药工业
• 1.1.4 纤维素酶的生产
• 1.2 纤维素酶的分离纯化
• 1.2.1 沉淀
• 1.2.2 凝胶过滤
• 1.2.3 吸附层析
• 1.2.4 离子交换层析
• 1.2.5 高效液相色谱
• 1.2.6 亲和层析
• 1.2.7 凝胶电泳
• 1.3 纤维素酶的动力学研究
• 1.3.1 动力学模型
• 1.3.2 酶促反应动力学
• 1.3.3 抑制动力学
• 1.3.4 化学修饰动力学
• 1.4 论文研究的主要内容和意义
• 2 实验材料
• 2.1 主要药品
• 2.2 主要仪器
• 2.3 主要试剂
• 2.4 供试菌株
• 3 纤维素酶中内切β-葡聚糖苷酶的分离纯化
• 3.1 硫酸铵盐析
• 3.1.1 原理
• 3.1.2 实验方法
• 3.1.2.1 粗酶液的制备
• 3.1.2.2 确定硫酸铵最佳饱和度区间及缓冲液的最佳pH
• 3.1.2.3 最佳条件下盐析
• 3.2 Sephadex G100凝胶柱层析
• 3.2.1 原理
• 3.2.2 实验步骤
• 3.3 DEAE FF弱阴离子交换柱层析
• 3.3.1 原理
• 3.3.2 实验方法
• 3.3.2.1 洗脱液pH和离子强度的选择
• 3.3.2.2 FPLC步骤
• 3.4 SDS-PAGE不连续垂直平板电泳
• 3.4.1 原理
• 3.4.2 分离胶浓度的选择
• 3.4.3 电泳步骤
• 3.5 纤维素酶活力的测定
• 3.5.1 3,5—二硝基水杨酸比色法（DNS法）测定还原糖浓度
• 3.5.1.1 原理
• 3.5.1.2 葡萄糖标准曲线的绘制
• 3.5.1.3 求取还原糖浓度
• 3.5.2 纤维素酶活力的测定
• 3.5.2.1 内切β-葡聚糖苷酶活力的测定
• 3.5.2.2 外切β-葡聚糖苷酶活力的测定
• 3.5.2.3 β-葡萄糖苷酶活力的测定
• 4 内切β-葡聚糖苷酶的动力学
• 4.1 最适反应温度
• 4.2 最适pH
• 4.3 米氏常数Km和最大反应速率Vmax
• 4.4 葡萄糖对内切β-葡聚糖苷酶热稳定性影响机理模型及热动力学
• 4.4.1 葡萄糖对内切酶热稳定性影响的机理模型及验证
• 4.4.2 内切酶的热动力学参数
• 4.5 pH值对内切β-葡聚糖苷酶活力影响的酶催化动力学模型
• 4.5.1 动力学模型的建立
• 4.5.2 动力学模型的验证
• 4.6 糖对内切β-葡聚糖苷酶的作用动力学
• 4.6.1 葡萄糖、半乳糖和蔗糖对内切酶的作用
• 4.6.2 D-果糖对内切酶的作用
• 4.6.3 动力学机理分析
• 4.7 甲醇对内切β-葡聚糖苷酶侧链基团的化学修饰
• 4.7.1 内切酶的部分纯化和浓缩
• 4.7.2 甲醇修饰侧链基团的确定
• 4.7.3 甲醇对内切酶活力的影响
• 4.7.4 底物和葡萄糖对化学修饰的影响
• 4.7.5 化学修饰的时间进程分析
• 4.7.6 化学修饰对内切酶构象的影响
• 5 结果与讨论
• 5.1 纤维素酶系中内切β-葡聚糖苷酶的分离纯化
• 5.1.1 黑曲霉产内切酶的分离纯化
• 5.1.1.1 盐析
• 5.1.1.2 Sephadex G100凝胶柱层析
• 5.1.1.3 DEAE FF弱阴离子交换柱层析
• 5.1.1.4 SDS-PAGE不连续垂直平板电泳
• 5.1.2 绿色木霉MJ1产内切酶的分离纯化
• 5.1.2.1 盐析
• 5.1.2.2 Sephadex G100凝胶柱层析
• 5.1.2.3 DEAE FF弱阴离子交换柱层析
• 5.1.2.4 SDS-PAGE不连续垂直平板电泳
• 5.2 内切β-葡聚糖苷酶动力学研究
• 5.2.1 最适反应温度
• 5.2.1.1 黑曲霉产内切酶的最适反应温度
• 5.2.1.2 绿色木霉MJ1产内切酶的最适反应温度
• 5.2.2 最适pH
• 5.2.2.1 黑曲霉产内切酶的最适pH
• 5.2.2.2 绿色木霉MJ1产内切酶的最适pH
• 5.2.3 米氏常数Km和最大反应速率Vmax
• 5.2.3.1 黑曲霉产内切酶的Km和Vmax
• 5.2.3.2 绿色木霉MJ1产内切酶的Km和Vmax
• 5.2.4 葡萄糖对内切β-葡聚糖苷酶热稳定性影响机理模型及热动力学
• 5.2.4.1 葡萄糖对内切酶热稳定性影响机理模型及验证
• 5.2.4.2 内切酶的热动力学参数
• 5.2.5 pH值对内切β-葡聚糖苷酶活力影响的酶催化动力学模型
• 5.2.5.1 动力学模型的建立
• 5.2.5.2 动力学模型的验证
• 5.2.6 糖对内切β-葡聚糖苷酶的作用动力学
• 5.2.6.1 葡萄糖、半乳糖和蔗糖对内切酶的作用
• 5.2.6.2 D-果糖对内切酶的作用
• 5.2.6.3 动力学机理分析
• 5.2.7 甲醇对内切β-葡聚糖苷酶侧链基团的化学修饰
• 5.2.7.1 甲醇修饰侧链基团的确定
• 5.2.7.2 甲醇对内切酶活力的影响
• 5.2.7.3 底物和葡萄糖对化学修饰的影响
• 5.2.7.4 化学修饰的时间进程分析
• 5.2.7.5 化学修饰对内切酶构象的影响
• 结论
• 展望
• 参考文献
• 致谢
• 硕士论文期间发表论文清单