葡萄糖-1-磷酸高产菌株的选育及发酵条件优化

论文摘要

葡萄糖-1-磷酸（G-1-P）是糖代谢中重要的中间产物,由磷酸化酶催化体内多糖磷酸解而产生的,在葡萄糖磷酸变位酶的作用下转变成葡萄糖-6-磷酸进入糖酵解,是重要的能量物质；作为重要的起始反应物,葡萄糖-1-磷酸可用于二磷酸葡萄糖核苷、麦芽寡糖及海藻糖等重要物质的生物合成；葡萄糖-1-磷酸具有重要的药用价值,是制备细胞增殖抑制剂、抗生素和抗癌剂等的原料。葡萄糖-1-磷酸的制备主要采用酶法合成,且有游离酶法和固定化酶法之分。酶法合成葡萄糖-1-磷酸虽然取得较大进展,但仍存在着种种不足,如磷酸化酶分离纯化过程烦琐且易失活、底物利用率和产物转化率不理想等,以致葡萄糖-1-磷酸的价格至今仍非常昂贵。为了早日实现葡萄糖-1-磷酸的工业化生产及其应用,本论文试图采用微生物直接发酵的方法来生产葡萄糖-1-磷酸。通过试验,筛选出一株能直接发酵产胞外葡萄糖-1-磷酸的菌株,经紫外诱变选育到一株高产菌,最后对高产菌株发酵条件进行了优化,其产量得到了进一步提高。具体研究内容及结果如下：1.采用筛选平板初筛、摇瓶发酵复筛结合薄层层析法（TLC）、高效液相色谱-质谱法（HPLC-MS）检测的方法,从有机物丰富的土壤中筛选到一株以麦芽糖为底物直接发酵高产胞外葡萄糖-1-磷酸的菌株；经形态学、生理生化特性及16S rDNA基因序列分析,鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌,命名为Bacillus sublitis XH-13。2.以菌株Bacillus sublitis XH-13作为出发菌株进行紫外诱变育种,采用筛选平板初筛、摇瓶发酵复筛结合高效液相色谱-质谱法（HPLC-MS）检测的方法,经过三轮紫外诱变后,筛选到一株葡萄糖-1-磷酸高产突变菌Bacillus subtilis XH-13UV3-8,其葡萄糖-1-磷酸产量为6.85mg/mL,是出发菌株产量的1.54倍,且经6次传代培养表现出良好的遗传稳定性,是很好的菌种选择。3.应用响应面法对Bacillus subtilis XH-13UV3-8发酵生产葡萄糖-1-磷酸的培养基组分及工艺条件进行了优化。在单因素试验基础上,首先采用Plackett-Burman设计法对12个相关影响因素的效应进行评价并筛选出了有显著正效应的酵母浸粉浓度和K2HP04·3H20浓度及有显著负效应的pH等3个因素；接着用最陡爬坡路径逼近最大响应区域；最后通过Box-Behnken法设计试验,利用Design-Expert软件对结果进行二次回归分析得到主要因素的最佳条件为：酵母浸粉0.82%、K2HPo4·3H2O0.72%和pH6.61。在此优化培养条件下,发酵液中葡萄糖-1-磷酸浓度从6.85mg/mL提高到8.56mg/mL。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 葡萄糖-1-磷酸的结构及功能
• 1.1.1 葡萄糖-1-磷酸的结构
• 1.1.2 葡萄糖-1-磷酸（G-1-P）的功能
• 1.2 磷酸化酶简介
• 1.2.1 α-葡聚糖磷酸化酶
• 1.2.2 麦芽糖磷酸化酶
• 1.3 酶法合成葡萄糖-1-磷酸的研究进展
• 1.3.1 国外研究进展
• 1.3.2 国内研究进展
• 1.4 本论文的研究目的及意义
• 1.5 本论文研究的基本内容
• 第二章 葡萄糖-1-磷酸产生菌株的筛选及鉴定
• 2.1 前言
• 2.2 试验材料
• 2.2.1 菌株来源
• 2.2.2 主要试剂
• 2.2.3 主要仪器设备
• 2.2.4 培养基
• 2.3 试验方法
• 2.3.1 筛选
• 2.3.2 鉴定
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 菌种筛选
• 2.4.2 菌种鉴定
• 2.5 本章小结
• 第三章 葡萄糖-1-磷酸产生菌株的紫外诱变育种
• 3.1 前言
• 3.2 试验材料
• 3.2.1 菌株
• 3.2.2 主要试剂
• 3.2.3 主要仪器设备
• 3.2.4 培养基
• 3.3 试验方法
• 3.3.1 Bacillus sublitis XH-13生长曲线的测定
• 3.3.2 摇瓶培养方法
• 3.3.3 葡萄糖-1-磷酸（G-1-P）的测定
• 3.3.4 第一轮紫外诱变
• 3.3.5 第二轮紫外诱变
• 3.3.6 第三轮紫外诱变
• 3.3.7 突变菌株稳定性的测定
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 菌株Bacillus sublitis XH-13的生长曲线
• 3.4.2 紫外诱变最佳菌体浓度的确定
• 3.4.3 最佳紫外诱变时间的确定
• 3.4.4 三轮紫外诱变结果
• 3.5 本章小结
• 第四章 响应面法优化葡萄糖-1-磷酸高产菌株的发酵条件
• 4.1 前言
• 4.2 试验材料
• 4.2.1 菌株
• 4.2.2 主要试剂
• 4.2.3 主要仪器设备
• 4.2.4 培养基
• 4.3 试验方法
• 4.3.1 摇瓶培养方法
• 4.3.2 葡萄糖-1-磷酸（G-1-P）的测定
• 4.3.3 单因素试验
• 4.3.4 响应面法优化
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 单因素试验
• 4.4.2 响应面法优化
• 4.5 本章小结
• 第五章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 附录
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历