毕赤酵母表达硒代重组人血清白蛋白和几种豆科植物有机硒含量的比较

论文摘要

硒（Selenium）是生物体必需的微量元素，具有抑制癌症、延缓衰老等作用，含硒药物的开发已成为一个研究热点。人血清白蛋白（HSA）也具有很高的药用价值，但是安全性限制了血源HSA的广泛应用。本文根据加入亚硒酸钠后酵母便可以产生硒代氨基酸的思路，把转基因毕赤酵母在含硒基质中培养，以期得到营养价值高、毒性小、利于吸收利用的硒代重组蛋白质。将能够成功表达重组人血清白蛋白（rHSA）的巴斯德毕赤酵母培养至诱导期后，流加亚硒酸钠，对照发酵液不加入亚硒酸钠，通过对比相同菌株在两组培养基中表达的rHSA的含硒量，判断硒能否以硒代氨基酸（SeMet，SeCys）的形式存在于重组蛋白质中。发酵液经热处理、超滤、离子交换和丙酮沉淀等步骤后，进行Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳、X射线能量色散谱（EDX）和原子吸收分析。结果表明，加硒发酵液样品中硒元素的质量分数比对照多23.2％，硒与蛋白质的质量比为0.0069，高于对照发酵液近35倍，初步证明无机硒可以被毕赤酵母同化，转化为硒代氨基酸，并形成硒代重组蛋白质。豆科植物的蛋白质含量高，营养丰富，有很好的保健功效，是对无机硒进行生物有机化的理想载体，具有较强的生物富集能力。本文通过对不同品种豆科植物的硒含量进行了比较发现，来自低硒地区的9号芸豆、10号奶花豆的蛋白富硒能力比较好，10号尤其明显；来自高硒地区的1号大豆中硒含量也较高，而且大豆蛋白的营养价值高于其它豆科植物蛋白；最终确定豆科植物蛋白的提取方法为：浸泡、研磨、过滤制浆、离心、丙酮沉淀、蛋白烘干。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一章 绪论
• 1.1 硒元素简介
• 1.1.1 硒的认识过程
• 1.1.2 硒的生理生化作用
• 1.1.3 硒与人体疾病
• 1.1.3.1 硒与肿瘤
• 1.1.3.2 硒与心血管疾病
• 1.1.3.3 硒与衰老
• 1.1.3.4 硒与克山病
• 1.1.3.5 硒与糖尿病
• 1.1.3.6 硒与白内障
• 1.1.3.7 硒与甲状腺疾病
• 1.1.4 硒的营养学研究
• 1.1.4.1 硒的摄入量与人体健康
• 1.1.4.2 人体补硒途径
• 1.1.4.3 硒的安全性和耐受剂量范围
• 1.1.5 有机硒药物研究进展
• 1.2 人血清白蛋白
• 1.2.1 人血清白蛋白理化性质
• 1.2.2 人血清白蛋白的生理功能
• 1.2.3 人血清白蛋白的市场需求
• 1.2.4 人血清白蛋白的来源
• 1.2.5 重组人血清白蛋白表达进展
• 1.3 毕赤酵母表达系统
• 1.3.1 毕赤酵母表达系统的优点
• 1.3.2 毕赤酵母表达外源蛋白的一般步骤
• 1.3.3 培养条件
• 1.3.4 产物稳定性
• 1.3.5 甲醇代谢途径
• 1.3.6 总结和展望
• 1.4 豆科植物硒蛋白研究进展
• 1.4.1 豆科植物硒蛋白开发现状
• 1.4.2 豆科植物硒蛋白的功能
• 1.4.3 我国豆科植物硒蛋白开发的不足
• 1.4.4 豆科植物硒资源的开发利用方向
• 1.5 课题的意义与主要研究内容
• 1.5.1 课题的目的和意义
• 1.5.2 课题的主要研究内容
• 第二章 重组人血清白蛋白菌种的复壮
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 培养基
• 2.2 实验仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 工业培养基中rHSA的发酵
• 2.3.2 菌种复壮
• 2.3.3 菌种保存
• 2.4 分析方法
• 2.4.1 酵母细胞密度分析
• 2.4.2 发酵液中残余甘油浓度的测定
• 2.4.2.1 原理
• 2.4.2.2 方法
• 2.4.2.3 甘油含量的计算
• 2.5 结果与讨论
• 2.5.1 保存菌种GS115-rHSA-8的生长曲线和甘油消耗曲线
• 2.5.2 菌种复壮结果
• 2.5.3 复壮前后菌体生长曲线及残余甘油量曲线的对比
• 本章小结
• 第三章 硒代rHSA的表达分离及硒含量的检测
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 培养基
• 3.2 实验仪器
• 3.3 试验方法
• 3.3.1 发酵
• 3.3.2 发酵液预处理
• 3.3.3 浓缩和脱盐
• 3.3.4 离子交换层析
• 3.3.5 蛋白质的沉淀收集
• 3.4 分析方法
• 3.4.1 酵母细胞质量浓度分析
• 3.4.2 Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳测定蛋白质相对分子质量
• 3.4.2.1 原理
• 3.4.2.2 各种溶液的配制
• 3.4.2.3 制胶
• 3.4.2.4 电泳
• 3.4.2.5 染色和脱色
• 3.4.2.6 注意事项
• 3.4.3 考马斯亮兰染色法测定总蛋白质量浓度
• 3.4.3.1 原理
• 3.4.3.2 各种母液的配制
• 3.4.3.3 标准曲线的测定
• 3.4.3.4 发酵液样品的测定
• 3.4.4 X射线能量色散谱分析（EDX）硒含量
• 3.4.4.1 原理
• 3.4.4.2 样品预处理
• 3.4.4.3 制作EDX检测样品
• 3.4.4.4 进行EDX分析
• 3.4.5 原子吸收光谱法测定硒含量
• 3.4.5.1 原理
• 3.4.5.2 原子吸收光谱法分析硒含量
• 3.5 结果与讨论
• 3.5.1 亚硒酸钠对毕赤酵母的影响
• 3.5.2 蛋白质相对分子量分析
• 3.5.3 EDX能谱分析
• 3.5.4 原子吸收测定蛋白质中的硒含量
• 本章小结
• 第四章 豆科植物有机硒含量的比较
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 原料及来源
• 4.1.2 试剂
• 4.2 实验仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 豆浆的制备
• 4.3.2 豆类蛋白的提取
• 4.3.3 蛋白质的干燥
• 4.3.4 硒含量测定
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 土壤硒对豆科植物有机硒含量的影响
• 4.4.2 不同品种的豆类蛋白有机硒含量的比较
• 4.4.3 蛋白质提取方法的影响
• 4.4.4 蛋白质干燥方法的比较
• 本章小结
• 第五章 结论与建议
• 5.1 结论
• 5.2 建议
• 参考文献
• 附录 培养基配方
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录
• 作者和导师简介
• 北京化工大学硕士研究生学位论文答辩委员会决议书