大鼠UCHL1基因RNAi重组慢病毒的构建、鉴定及功能研究

论文摘要

目的设计、构建、筛选针对大鼠UCHL1基因的RNA干涉（RNAi）重组慢病毒表达系统,观察RNAi重组慢病毒对UCHL1表达水平以及对神经元存活、生长以及凋亡的影响,为下一步探讨UCHL1表达改变对神经元损伤和修复的意义提供前期研究基础。方法1.选用质粒pWPXL-MOD构建UCHL1基因重组表达载体,取得阳性克隆并命名为pWPXL-MOD-UCHL1并通过鉴定。2.应用siRNA设计工具针对大鼠UCHL1基因设计三条特异性siRNA靶序列,同时设计一条Negative序列用于对照组实验,合成的寡核苷酸。3.选用粘末端线性质粒pRNAT-U6.2构建UCHL1 siRNA表达载体。将3个双粘UCHL1靶向发卡DNA片段（shRNA）和1个无关对照序列发卡DNA片段（NEGTIVI三）,分别与pRNAT-U6.2连接,将重组载体转化感受态细胞,用pRNAT-U6.2的插入鉴定引物进行PCR鉴定,得到阳性重组子,分别命名为pRNAT-U6.2-shRNA1,pRNAT-U6.2-shRNA2,pRNAT-U6.2-shRNA3和pRNAT-U6.2-NEG;对插入序列进行DNA序列测定,提取质粒备用。4.常规方法培养293FT细胞,pWPXL-MOD-UCHL1,pRNAT-U6.2-shRNA1,pRNAT-U6.2-shRNA2,pRNAT-U6.2-shRNA3和pRNAT-U6.2-NEG质粒分别与慢病毒包装质粒混合物(TELEVECTORTM)共转染293FT细胞;生产和纯化病毒,分别命名为Lv-UCHL1,Lv-shRNA1,Lv-shRNA2,Lv-shRNA3,Lv-shNEG,使用杀稻瘟素测定病毒的滴度。5.使用重组慢病毒Lv-UCHL1,Lv-shRNA1,Lv-shRNA2,Lv-shRNA3,Lv-shNEG及空病毒感染293FT细胞,使用倒置荧光显微镜观察荧光,确定慢病毒感染目的细胞的效率;以GADPH为内参照,通过Western-blot分析293FT细胞UCHL1蛋白表达水平的改变,选择出抑制效率最高的RNAi慢病毒以供后续实验。6.体外分离、培养大鼠脑皮层神经元,通过形态学、NSE和Hochest33258荧光染色等方法鉴定神经元,建立稳定的实验研究模型。7.用RNAi重组慢病毒、空病毒分别转染体外培养的神经元,使用倒置荧光显微镜观察荧光,确定慢病毒感染目的细胞的效率,通过RT-PCR、Western-blot检测UCHL1在mRNA和蛋白水平的表达,确认干涉效果。8.观察转染后神经元形态,采用MTT比色法检测细胞存活和生长等生物学行为的改变,采用流式细胞技术和Annexin V染色检测细胞的凋亡。结果1.成功地构建了UCHL1基因重组质粒,取得了阳性克隆并通过了鉴定。2.成功地设计和构建了针对UCHL1基因的siRNA慢病毒载体。3.在293FT细胞中成功地包装和生产了UCHL1和RNAi重组慢病毒并进行了滴度测定。4.使用RNAi重组慢病毒转染293FT细胞成功地筛选出对UCHL1抑制率最高的病毒。5.成功地分离、培养了大鼠脑皮层神经元,建立稳定的实验研究模型。6.使用RNAi重组慢病毒稳定转染体外培养的皮层神经元,UCHL1的mRNA和蛋白表达水平均明显下调。7.RNAi重组慢病毒抑制UCHL1表达后,体外培养的皮层神经元的生长受到抑制,细胞凋亡比例显著提高。结论慢病毒作为siRNA的携带者,不但具备特异性地使基因表达沉默的能力,而且充分发挥了慢病毒载体自身所具备的优势,为基因功能的研究提供了更强有力的工具。通过建立稳定的鼠皮层神经元体外培养模型,为进一步利用RNAi技术进行基因表达调控的研究奠定了基础。UCHL1高度特异性地分布于神经元,是一种在泛素化蛋白降解途径中起到关键的作用的酶。通过RNAi重组慢病毒转染体外培养的神经元可以稳定、高效、特异性地抑制UCHL1的表达,并对神经元的存活、生长和凋亡产生很大影响。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 一、UCHL1基因RNAi慢病毒表达系统的构建与鉴定
• 1.1 对象和方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 1.4 小结
• 二、新生大鼠皮层神经元原代培养
• 2.1 对象和方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 三、UCHL1基因RNAi慢病毒表达系统转染神经元的实验研究
• 3.1 对象和方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 附录
• 综述
• RNAi技术与UCH-L1的研究进展
• 综述参考文献
• 致谢