论文摘要
随着各国有关GMO标签法的建立和不断完善,对食品中的GMO含量的下限已有所规定且不断下降。但目前为止,国际上尚未建立对粮食作物深加工制品转基因成分准确的定性和定量检测技术。本实验对主要粮食作物深加工制品的转基因成分的检测技术进行了深入研究,旨在于建立一套深加工转基因制品的DNA提取、定性和定量检测技术体系,为最终建立快速、高效和准确的GMO标准检测方法提供依据。在DNA提取方法研究的方面,本文筛选了多种DNA提取技术和方法,结果将Wizard?试剂盒确定为深加工制品的最佳提取方法。与其它DNA提取方法相比较,该试剂盒提简单、快速,DNA富集效果最佳,所提取的DNA作为模板进行随后的定性和定量检测,得到最佳结果。在定性检测技术方面,本研究建立了多重巢式PCR转基因检测体系。针对已商品化的大豆、玉米和水稻主要含有Cry1A（B）基因、BAR基因、CP4-EPSPS基因、PAT基因及共同的内标准基因RBCL基因的特点设计了10对引物,其中包括5对外引物和5对内引物,对大豆、玉米和水稻经深加工的11个未知样品进行了多重巢式PCR定性检测。结果显示,在11份未知样品中,卵磷脂、大豆蛋白质粉、巧克力饮品、婴儿米粉含有转CP4-EPSPS基因成分;玉米淀粉和玉米泥含有转Cry1A（B）基因和PAT基因成分;玉米蛋白粉含有转Cry1A（B）基因和BAR基因成分;营养麦片含有转Cry1A（B）基因成分;大豆精炼油、大豆色拉油和玉米油在定性检测中未检测出任何条带,结果与巢式PCR结果一致。多重巢式PCR适用于转基因深加工制品的定性检测,灵敏度达到0.005%,优于已有的PCR检测方法,该定性检测方法具有特异、稳定、准确、可以筛选多种转基因成分的特点,为国际上转Cry1A（B）基因、BAR基因、CP4-EPSPS基因、PAT基因深加工制品转基因检测提供了有效的检测技术。另外,本研究还建立了基于熔解曲线的多重Real time PCR转基因定性检测体系。针对Cry1A（B）基因、BAR基因、CP4-EPSPS基因、PAT基因设计特异性强且每个基因扩增产物的解链温度各不相同的引物,进行多重Real time PCR反应。最终建立了对于Cry1A（B）基因、CP4基因与PAT基因、BAR基因的两个双重PCR反应体系,检测灵敏度都可达0.1%:对于CP4基因、PAT基因和BAR基因的的三重PCR反应,检测灵敏度为0.5%;对于Cry1A（B）基因、CP4基因、PAT基因和BAR基因的的四重PCR反应,检测灵敏度为1%,以上多重Real timePCR转基因检测体系的检测限度都低于已建立的GMO规范阈值。因此,这些最新建立的基于熔解曲线的Real-time PCR体系足以满足常规GMO定性检测。在定量检测技术方面,本研究建立了TaqMan和SYBR GreenⅠ两种方法的转基因定量检测体系,并比较二者检测结果。实验证明,TaqMan探针和SYBR GreenⅠ染料法在标准品定量分析试验中标准差均小于0.2,灵敏度均达到0.01%,两种方法的检测结果没有差异。同时SYBR GreenⅠ定量检测方法具有简便快速、经济实用、成本低、结果可信的特点,完全适用于深加工制品的转基因成分定量检测。此外,本研究还建立了基于多重PCR反应的基因芯片转基因检测体系,检测灵敏度可达0.25%。另外,本研究还构建了可以检测转CP4-EPSPS基因、Cry1A（B）基因、BAR基因和PAT基因的定性标准分子质粒,以解决实验室普遍缺乏阳性标准物质的问题。本研究建立了一整套简便、精确、快捷、成熟、可信度高的转基因粮食作物深加工制品检测技术体系,将为我国粮食作物转基因产品定性、定量检测标准化提供技术平台,为GMO标签制度进一步发展提供技术保证。