论文摘要
随着国家经济的发展,交通、建筑及矿难等事故中导致的脊髓损伤（spinal cordinjury,SCI）已成为威胁人们健康的重要因素,关于SCI的研究因而备受国内学者的高度关注。遗憾的是,迄今为止尚无有效治疗SCI的方法和药物,促使人们重新审视SCI的病理生理过程和致病机制。SCI后主要经历急性期和慢性期两大病理生理阶段,急性期病变主要以原发损伤启动的一系列继发损伤为主,导致损伤范围的扩大和损伤程度的加重,所以,研究SCI急性期继发损伤的机制,如何尽可能地保护原发损伤周围的正常脊髓免受继发损伤的波及,是SCI治疗的首要策略。SCI慢性期则以星形胶质细胞活化、反应性增生及胶质瘢痕（glial scar）和囊腔的形成为其主要病理特点,他们成为阻挡神经再生的重要屏障,至今尚无有效的处理方法。因此,研究胶质瘢痕形成的过程、瘢痕的厚度及其与神经纤维的关系,对深入理解胶质瘢痕的特点和重新审视它在脊髓损伤与修复中的作用,具有重要的意义和价值。研究发现急性期许多致病机制参与了SCI后的继发损伤过程,包括缺血、兴奋性毒性、炎症、氧化应激、代谢能量障碍等。近年来,有不少针对上述继发损伤机制药物的基础与临床研究,但迄今未见临床疗效,提示尚有其它不为人知的继发损伤机制。新近报道的酸敏感离子通道（acid-sensing ion channel,ASICs）为SCI的研究带来了新的启发,尤其是ASICs的亚基ASIC1a。因为SCI后多种因素均可导致局部组织微环境的酸化,例如缺血缺氧可致CO2等酸性代谢物无法带走,兴奋性氨基酸和ATP的释放（均是酸性物质）,代谢障碍致乳酸堆积,炎症亦可导致酸化。所以,SCI后的pH降低（组织酸化）可能较严重,它将激活ASIC1a通道,导致一系列病理过程。但脊髓中ASIC1a的表达分布及其在SCI后的变化,不甚清楚。所以,本课题将动态观察SCI后ASIC1a的变化特点,探讨其在SCI继发损伤中的作用及其可能机制。胶质瘢痕和囊腔的形成是SCI慢性期的重要病理变化,是导致SCI后神经再生修复失败的重要原因,研究发现即便通过神经移植桥接了囊腔坏死区,但移植物和神经纤维仍无法穿越致密的胶质瘢痕。因此,减少或去除胶质瘢痕是一项有希望的慢性期SCI治疗策略,但是有两条重要的因素决定着这一策略的效果:第一是瘢痕分布的特点如何?去除瘢痕的厚度应该是多少?囊腔周围的瘢痕厚度是否一致?如果去除瘢痕过多,会损及正常脊髓组织造成新的损伤。第二是去除胶质瘢痕的时间窗应如何选择?过早或过晚可能都存在问题。所以,本研究将动态观察胶质瘢痕形成过程、瘢痕的厚度及其与神经纤维的关系,为以上问题的回答提供实验依据。目的:1.动态观察SCI后胶质瘢痕形成规律及其与神经纤维的关系,并定量测量胶质瘢痕的厚度。2.观察ASIC1a在SCI后的表达变化特点,研究ASIC1a在SCI继发损伤中的作用及可能的分子机制方法:1.采用大鼠脊髓挫伤模型,应用组织病理学、行为学评分、诱发电位、免疫荧光技术及神经束路示踪等方法,观察SCI后组织病理变化过程、轴突再生与胶质瘢痕形成规律及相互关系,并测量瘢痕厚度。2.应用western blotting、免疫荧光及激光共聚焦显微镜、RT-PCR等方法多侧面观察SCI后ASIC1a表达变化规律,及其变化意义。3.利用体内、外损伤模型,使用TUNEL染色、电生理膜片钳记录、钙成像、鞘内置管给药、反义核酸等技术探讨ASIC1a在SCI继发损伤中的作用及其可能机制。结果:1.本研究首先制作了4种不同致伤级别的脊髓挫伤模型,应用组织病理学、行为功能评分、诱发电位、免疫荧光技术及神经束路示踪等方法,观察比较它们的病理学变化,神经功能恢复情况等,结果发现10g×50mm致伤组损伤很重,动物功能恢复较困难,10g×5mm致伤组则损伤太轻,动物基本可自行恢复到接近正常功能,10g×25mm致伤组功能恢复曲线显示早期与10g×50mm组类似,后肢瘫痪,后期类似10g×10mm致伤组。而10g×10mm致伤组动物自发功能恢复曲线稳定、独特,与其它3组区别明显。进一步,本研究比较了10g×25mm组和10g×10mm组在病理学、电生理学等方面的差异,结果显示这两种致伤级别,所导致的组织损伤程度与范围、运动/感觉诱发电位恢复等方面存在明显差别。2.本实验发现SCI后动物运动功能显著下降,以后逐渐恢复并在SCI后4w（week）左右恢复达平台。与之相应,神经电生理检查显示运动/感觉诱发电位的潜伏期在伤后明显延长,以后逐渐恢复,亦在SCI后4 w相对稳定。病理学观察表明SCI后2 w左右囊腔开始出现,到4 w时囊腔形成并较为稳定。动态观察胶质瘢痕的形成过程显示SCI后星形胶质细胞活化,胞体肥大,突起变粗并相互交联,逐渐形成胶质瘢痕,在SCI后4 w左右围绕在囊腔周围形成明显的胶质瘢痕带。以上结果提示大鼠SCI后4 w左右进入慢性期。3.应用神经束路示踪、免疫荧光双标等方法观察发现,SCI后神经纤维具有一定的再生能力,大部分走行于胶质瘢痕外,未见穿透瘢痕区达到囊腔边缘或穿透囊腔者,但也有部分轴突伸入到瘢痕外侧部一定的深度,提示胶质瘢痕是轴突再生之屏障。为将来瘢痕的去除提供了基础数据,本研究尚测量了SCI后4 w时胶质瘢痕的厚度,结果显示囊腔头尾侧瘢痕厚度与双侧壁厚度有一定差别,头尾侧厚度为107.00±20.12μm,双侧边瘢痕厚度为69.92±15.12μm。4.Western blotting和免疫荧光观察显示SCI后损伤周围区ASIC1a表达显著上调,在灰、白质均升高,并在12—24 h达高峰,然后逐渐回降,在SCI后1 w左右基本恢复到原先水平,连续观察6 w未见有变化。与此不同,SCI后损伤区ASIC1a的表达则下降,SCI后1 w左右即检测不到,应用Nissl及NeuN染色发现损伤区神经元丢失严重,可能与损伤区ASIC1a表达下降有关。免疫荧光双标显示灰质中主要为神经元表达ASIC1a,白质中则是少突胶质细胞表达ASIC1a。有趣的是,Western blotting观察发现正常脊髓ASIC2a表达水平很低,但SCI后损伤区与损伤周围区的表达均明显上升,尤其损伤周围区ASIC2a的表达升高持续到SCI后4w左右才恢复至原来水平。同样可能由于细胞的死亡,损伤区ASIC2a的表达早期升高后在24 h后迅速下降,直至检测不到。RT-PCR结果提示SCI后ASIC1a mRNA未见明显变化,而ASIC2a mRNA水平明显升高。5.应用TUNEL标记方法,发现TUNEL阳性细胞大多ASIC1a阳性,提示ASIC1a可能参与了SCI后延迟性细胞死亡的发生。相反,TUNEL阳性细胞则基本上未见ASIC2a阳性,一方面提示ASIC2a可能没有参与SCI后继发的细胞死亡,另一方面反过来说明ASIC1a与TUNEL的共标是特异的。进一步,利用体内、外损伤模型,结合TUNEL、PI/FDA染色等方法,发现分别给予ASIC1a的特异性阻断剂PcTx1和非特异性阻断剂Amiloride均可降低损伤后细胞死亡。ASIC1a特异的反义核酸knock downASIC1a的表达也可以达到同样的保护效果。6.应用电生理膜片钳记录与Ca2+成像技术,发现酸（pH6.0）刺激下可诱发脊髓神经元一较大的内向电流（酸电流）,亦可引起胞内Ca2+浓度迅速的增加,此电流和Ca2+内流可被ASIC1a通道特异性阻断剂阻断。在模拟的SCI后继发的缺血缺氧病理条件下,ASIC1a介导的酸电流和Ca2+内流均出现增强效应。7.进一步的实验显示病理条件下ASIC1a通道功能的增强可能和其磷酸化有关,Co-IP实验确实发现SCI后ASIC1a磷酸化水平显著升高,而钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）可能参与了这一过程。Western blotting结果显示SCI后CaMKⅡ的表达显著升高,其表达变化的时空特点和ASIC1a具有良好的相关性,应用CaMKⅡ的特异性抑制剂KN93可显著抑制缺血缺氧诱发的ASIC1a介导的酸电流和Ca2+内流的增强效应,并减轻细胞损伤。8.最后,为在整体水平验证ASIC1a在SCI中的作用,应用鞘内置管技术,分别给予SCI大鼠ASIC1a的特异性阻断剂PcTx1和非特异性阻断剂Amiloride,结果发现两者均可减轻组织损伤,促进动物运动功能的恢复。ASIC1a特异的反义核酸亦具有类似的保护效果。结论:1.本研究所采用的SCI模型不仅能够将不同级别损伤区分开,且与动物行为学、电生理学和组织病理学变化想吻合。故本研究采用的模型具有较好的客观性、稳定性、相关性和重复性。2.10g×10mm致伤组动物自发功能恢复曲线稳定、独特,与其它不同级别的损伤区别明显,可较客观地反映不同SCI治疗措施和药物的疗效,故本研究采用此致伤级别。3.综合行为学、电生理学、病理学及胶质瘢痕形成观察等多方面的证据提示大鼠SCI后4 w左右进入慢性期,为人们认识和研究慢性SCI提供了重要的实验依据。4.SCI后神经纤维具有一定的再生能力,但很少能穿透胶质瘢痕,说明胶质瘢痕是阻挡轴突延伸的重要因素,提示去除胶质瘢痕可能是治疗SCI的重要策略,本研究测量了瘢痕的厚度,为将来去除瘢痕提供了重要的时空参考数据。5.SCI后ASIC1a表达上调明显,且在灰、白质均升高,在12—24 h达高峰,SCI后1 w左右回降到原先水平。免疫双标鉴定白质中表达ASIC1a的细胞类型是少突胶质细胞。ASIC1a表达的上调可能与其转录水平无关,而与翻译和/或代谢有关。6.体内外实验均表明ASIC1a确实参与了SCI后的继发性损伤,其可能过程为:SCI后出现的组织酸化可激活ASIC1a通道,引起一、二价阳离子的内流,尤其是Ca2+内流,导致胞内Ca2+蓄积,导致细胞损伤,SCI后ASIC1a表达的升高加剧了这一损伤过程。7.在SCI后继发的缺血缺氧病理条件下ASIC1a通道功能出现增强效应,此效应可能与钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）介导的ASIC1a的磷酸化水平升高有关。而CaMKⅡ的激活可能与ASIC1a通道介导的Ca2+内流有关。8.本研究显示SCI后的组织酸化及其激活的ASIC1a通道是SCI后继发损伤的新的致病机制,为将来设计以ASIC1a为干预靶点的、特异的SCI治疗新药物,提供了重要的实验依据。综上所述,组织酸化及ASIC1a通道在SCI的继发损伤中起了重要作用,其可能机制是:SCI后组织酸化并伴随ASIC1a表达增多,H+激活ASIC1a通道,引起Ca2+内流,组织酸化持续存在导致胞内Ca2+的蓄积,激活CaMKⅡ,然后CaMKⅡ反作用于ASIC1a,增加其磷酸化,引起ASIC1a通道功能增强,通Ca2+增加,胞内Ca2+增加进一步激活CaMKⅡ,形成恶性循环,导致细胞Ca2+超载,引起细胞损伤,SCI后ASIC1a表达的升高加剧了这一损伤过程。本课题首次揭示了ASIC1a介导的酸毒在SCI继发损伤中的重要作用,加深了人们对SCI继发损伤机制的认识,为将来设计以ASIC1a为干预靶点、特异性的SCI治疗新药物和新策略,提供了重要的实验依据,具有重要的理论意义和临床应用价值。
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