抗登革病毒E蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

论文摘要

目的:登革病毒（Dengue virus,DV）感染致死率高,登革热在世界范围内发病率不断升高,而目前尚无有效疫苗和特效药物,因此登革病毒感染的快速诊断有重要意义。登革病毒包膜蛋白E蛋白是重要的抗原蛋白,与免疫保护密切相关。本研究通过原核表达纯化E蛋白,利用杂交瘤技术制备DV-E特异性单克隆抗体,为进一步制备胶体金试纸奠定基础。方法:1.采用PCR法扩增E基因片段,原核表达载体pET 32-a及PCR产物经双酶切后,用T4DNA连接酶将两者连接并转化到大肠杆菌JM109构建并筛选重组质粒。随后将重组质粒转入表达宿主BL21感受态细胞,经IPGT诱导表达,对表达蛋白进行SDS-PAGE电泳分析和Western-blot检测。以Ni2+-NTA树脂亲和层析纯化重组蛋白。2.用重组E蛋白作为抗原免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术,制备抗DV-E的单克隆抗体,用ELISA方法筛选分泌抗DV-E单克隆抗体的杂交瘤细胞株,采用间接ELISA方法和Western-blot进行McAb特异性鉴定;同时采用间接ELISA方法鉴定McAb的Ig亚类,检测McAb的效价。结果:1.采用PCR方法扩增得到与预期大小一致的目的基因片段。重组质粒经PCR鉴定及测序分析证实重组质粒克隆成功,命名为pET 32-a-E。转化表达宿主菌后成功诱导出分子量为70kD的重组E蛋白,与预期分子量相符。Western-blot检测表明诱导表达的融合蛋白能与抗DV的血清发生特异性结合。采用Ni2+-NTA树脂亲和层析纯化得到重组蛋白。2.成功筛选出一株可分泌特异性McAb的杂交瘤细胞7C7,其抗体亚类为IgG1;将生长良好的杂交瘤细胞接种到预处理的Balb/c小鼠腹腔中制备腹水型DV-E的单克隆抗体,酶联免疫吸附试验（ELISA）证明腹水效价可达10-6; Western-blot鉴定结果提示该单克隆抗体可以特异结合DV-E。结论:综上所述,我们运用重组DNA技术与原核表达方法获得了重组E蛋白,利用该蛋白成功制备了抗DV-E单克隆抗体,所得抗体具有生物学活性,其抗体亚类为IgG1。为进一步制备快速检测登革病毒的胶体金试纸条奠定了坚实的基础。

论文目录

• 英汉缩略语名词对照
• 摘要
• ABSTRACT
• 抗登革病毒E 蛋白单克隆抗体的制备和鉴定
• 前言
• 第一部分 登革病毒E 融合蛋白的表达、纯化及性质鉴定
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 2.1 含E 基因片段的表达质粒的构建
• 2.2 含E 基因片段的融合蛋白在大肠杆菌中表达及纯化
• 2.3 表达产物的免疫印迹鉴定（WESTERN BLOT检测）
• 3. 讨论
• 第二部分 抗登革病毒E 蛋白单克隆抗体的制备及特性研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3. 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 文献综述
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文