论文题目: 植酸酶基因的克隆及转化玉米的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 作物栽培学与耕作学
作者: 农友业
导师: 吴子恺
关键词: 米曲霉,植酸酶基因,毕赤酵母,表达,玉米,愈伤组织,农杆菌,转化
文献来源: 广西大学
发表年度: 2005
论文摘要: 玉米(Zea mays L.)是世界上第三大粮食作物,是饲料的主要原材料之一。中国是世界上第二大玉米生产国。在玉米等植物的籽粒中,植酸(myo-inositol hexakisphosphate)是磷的主要贮存形式,植酸磷占总磷50%～80%以上。种子萌发时,植酸被植酸酶分解产生肌醇和游离的磷酸盐,作为植物幼苗生长的营养来源。动物所需要的镁、钙、铁、锌等阳离子也因与植酸结合成植酸盐而被固定,使动物不能吸收镁、钙、铁、锌等阳离子,因此,植酸盐是磷营养和矿质营养的关键因素。理论上,玉米及大豆中所含的磷能满足猪的需要,但由于植酸的存在侵饲料中约2/3的磷不能被猪利用。近20年的研究证明,猪只能利用玉米中磷的10%～20%,豆饼中磷的25%～35%,这意味着在猪生长和育肥曰粮中,由玉米和豆粕提供的磷只有约15%被利用。 由于在非反刍动物(如猪、家禽等)的消化道内缺少植酸酶而不能利用食物中的植酸,使植酸磷随粪便排出。因此高植酸粪便造成土壤及水体中磷的含量增高,从而也对环境造成影响。在饲料中添加植酸酶或将植酸酶基因转到玉米等饲料原料中,使其表达后产生植酸酶在动物的胃肠中起作用,分解饲料中的植酸,释放出磷,提高饲料中磷的利用率,提高饲料的营养价值。同时,减少磷随粪便的排出量,对提高企业经济效益及减少饲养业对环境的影响都有非常重要的意义。 基于上述原因,我们根据已发表的植酸酶基因序列设计引物,选用生长速度快,且在国内外还没有报道的米曲霉,提取其总DNA并纯化后,以此DNA为模板,首次利用PCR从米曲霉中克隆得到植酸酶基因,并将植酸酶基因序列的第一个碱基“C”改为“A”。对克隆到的植酸酶基因序列进行测序,然后将其在GeneBank里进行对比,结果我们克隆得到的植酸酶基因与植酸酶基因:GI:22901877、GI:4185609、GI:11992744、GI:17043775的同源性分别为98.7%、88.8%、84.5%和66.4%。我们将其在GeneBank进行注册(注册号为GI:47176935)。 为了证明克隆得到的植酸酶基因的有效性,我们构建了毕赤酵母(Pichia pastoris)的表达载
论文目录:
摘要
Abstract
第一部分 植酸酶基因的克隆及其在Pichiapastoris中表达的研究
1.前言
1.1 植酸及其特性
1.1.1 植酸的发现
1.1.2 植酸的应用
1.1.3 植酸的结构
1.1.4 植酸的理化特性
1.1.5 植酸的分布
1.1.6 植物性饲料原料中植酸磷占总磷的含量
1.1.7 植酸的抗营养作用及对环境的影响
1.2.植酸酶的来源、种类及其生物学特性
1.2.1 植酸酶的来源
1.2.2 植酸酶的种类
1.2.3 植酸酶分子结构与空间构象
1.2.4 植酸酶的特性
1.2.5 植酸酶的作用
1.2.6 植酸酶的作用机理
1.2.7 植酸酶基因工程的研究进展
1.2.8 植酸酶基因工程的一个新突破点
1.3.本研究的主要目的及内容
1.4.本研究采用的技术路线
2.材料与方法
2.1 材料
2.2 方法
3.结果与分析
3.1 米曲霉总DNA的提取
3.2 植酸酶基因的PCR扩增及测序
3.3 pPIC9K-phyA表达载体的构建
3.4 pPIC9K-phyA转化Pichia pastoris及转化子的检测
3.5 表达载体pPIC9K-phyA转化Pichia pastoris(GS115)
3.6 多拷贝转化子的筛选
3.7 植酸酶基因的诱导表达
3.8 酶活性测定
4.讨论
第二部分 植酸酶基因转化玉米的研究
1.前言
1.1 粮食问题面临的严峻形势
1.2.作物转基因育种的意义
1.3.玉米转基因研究进展
1.4.农杆菌介导玉米遗传转化问题与分析
1.5 研究目的与内容
2.材料与方法
2.1 材料
2.2 方法
3.结果与分析
3.1 引物的设计及植酸酶基因的克隆
3.2 植物表达载体pCambia1301-35SN-phyA的构建
3.3植物表达载体导入农杆菌
3.4 农杆菌介导玉米遗传转化
3.5 农杆菌介导玉米愈伤组织的转化
4.讨论与结论
4.1 植酸酶基因
4.2 遗传转化的受体系统
4.3 农杆菌
4.4 载体系统
4.5 启动子
4.6 选择标记
4.7 抑菌性抗生素
4.8 影响农杆菌转化的因素
4.9 受体细胞的生理状态
4.10 干燥处理
4.11 抗性植株
参考文献
致谢
发布时间: 2005-07-21
参考文献
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