论文摘要
随着抗生素、糖皮质激素和免疫抑制剂的广泛应用,许多与人体共栖的真菌成为机会致病菌。研究表明:念珠菌是所有真菌感染菌种的首位。另据统计侵袭性曲霉病(IA)患者从被检测出到死亡通常少于14天,因此迫切要求我们不仅要早期、快速诊断深部真菌病,还要在最短的时间里将致病菌鉴定到种的水平,以选择敏感有效的药物进行治疗。传统的致病菌鉴定是建立在临床标本真菌培养阳性的基础上,这意味着必须等待数天到数周的时间才能进行下一步的菌种检定。而据统计临床上45%～75%的播散性念珠菌病患者及更多的IA患者血培养阴性,这就限制了该方法的应用范围,使得培养阴性的含菌标本无法被用来检定菌种。因此,我们尝试应用新建立的方法在体外对临床患者的尿液、肺泡灌洗液、腹腔引流液和胆汁等标本进行PCR法快速检定,以期解决上述难题,更好地服务于临床。本研究同时应用PCR法和荧光定量PCR法对临床标本进行既定性又定量的检测,是分子生物学在临床直接用于真菌检测的初步尝试。第一部分PCR法快速检定模拟体液中致病真菌的研究目的用新建立的PCR法快速检定模拟体液中的致病真菌。方法应用真菌通用引物ITS4和ITS86对模拟体液中悬浮的致病真菌进行PCR法快速检定,扩增产物与对照组——相应菌种采用传统方法抽提DNA后扩增片段的扫描分析结果相对照。结果模拟体液菌悬液扩增片段的扫描分析结果与DNA扩增结果相近,差异无显著性,整个实验过程仅需7h。结论采用ITS通用引物对模拟体液中悬浮的致病真菌进行快速PCR法检定,可准确、特异、快速、敏感地检测致病菌。第二部分PCR法快速检定临床体液标本中致病真菌的研究目的用PCR法快速检定临床体液标本中的致病真菌。方法应用真菌通用引物ITS4和ITS86对临床体液标本中的致病真菌进行PCR法快速检定,扩增产物与对照组——相应菌种采用传统方法抽提DNA后扩增片段的扫描分析结果相对照。结果临床体液标本直接进行PCR扩增片段的扫描分析结果与DNA扩增结果相近,差异无显著性。结论采用ITS通用引物对临床体液标本中致病真菌进行快速PCR法检定,可准确、特异、快速、敏感地检测致病菌。第三部分PCR法检定临床体液标本前瞻性研究目的对深部真菌感染快速PCR诊断方法的敏感性和特异性进行评价。方法应用真菌通用引物ITS4和ITS86对83例临床体液标本中的致病真菌进行PCR法快速检定,并与其传统检验方法之结果进行比较,作统计学分析。结果临床体液标本直接进行PCR扩增的阳性率与传统检验方法阳性率,经统计学比较分析,结果差异无统计学意义。结论采用ITS通用引物对临床体液标本进行前瞻性PCR法检定,可准确、特异、快速、敏感地检测致病菌。第四部分应用荧光定量PCR法检测临床体液标本中的真菌量目的应用荧光定量PCR法检测深部真菌病临床体液标本中的真菌含量。方法应用白念珠菌特异性引物和荧光探针对临床体液标本中的菌含量进行荧光定量PCR检测,通过在PCR过程中的荧光信号的变化记录Ct值,并根据Ct值推算出起始模版的数量。结果临床体液标本直接进行荧光定量PCR检测可准确的给出所含真菌的拷贝数,给被检测样本以定量分析。结论应用白念珠菌特异性引物和荧光探针对临床体液标本中的菌含量进行荧光定量PCR检测,可准确、快速、定量地检测致病真菌含量。