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硝基酚降解菌pnpC基因的克隆表达与催化特性研究

2020-12-11阅读(162)

硝基酚降解菌pnpC基因的克隆表达与催化特性研究

论文摘要

硝基酚是化工合成的重要原料,广泛用于农药、炸药、染料等有机合成领域。这些化工产品如有机磷农药和硝基酚类除草剂在自然环境中水解产生对硝基酚（PNP）。PNP具生理毒性且难降解,是国标规定的三级污染物（危害性属最高一级）。PNP积累成为目前备受关注的环境问题。高效降解硝基酚污染、修复环境和保障公共健康已成为国内外研究者关注的热点问题。微生物酶法降解硝基酚具备高效、低成本和对环境友好的优点,已成为治理硝基酚污染的重要技术。本论文从PNP高效降解菌中克隆表达并分离纯化了PNP降解关键酶——偏苯三酚-1,2-双加氧酶（PnpC）,研究了重组酶的表达条件及催化特性。本研究以PNP高效降解菌Pseudomonas sp. HS-D38、Bacillus cereus HS-MP12和Bacillus cereus HS-MP13基因组为模板,PCR扩增偏苯三酚1,2-双加氧酶基因（分别编号为pnpC1/2/3）。PCR产物克隆到pMD-18,之后亚克隆到表达载体pET-28, pET-pnpC1/2/3分别转化E.coli BL21（DE3）, IPTG诱导高效表达重组PnpC1/2/3。优化表达条件,比较PnpC1/2/3可溶性表达差异。Ni-NTA亲和色谱纯化重组PnpC1 （HS-D38）并分析其催化特性。结果表明：pnpC1/2/3开放阅读框均为873 bp,同源性为99%,编码蛋白质相对分子量约为33 KD；37或20℃下,pnpC1/2/3在Ecoli BL21中均可高效表达,表达产物对邻苯二酚有邻位开环活性；37℃下,重组PnpC1/2/3都以包涵体表达为主,可溶性表达量很低；20℃下,重组PnpC1/3主要为可溶性表达,但重组PnpC2仍为包涵体表达；氨基酸序列比对表明：PnpC1/2差异为T12I/A202V, PnpC2/3差异为T12I/A202V/K230R,而PnpC1/3差异仅为K230R；重组PnpC1/2/3对邻苯二酚的开环活性分别为6.8、2.0和8.6 U/mL,比活力分别为0.25、0.22和0.29 U/mg；重组PnpC1经Ni-NTA亲和色谱分离可达到电泳纯,纯酶比活力9.3 U/mg,纯化倍数37.2,活力收率23.8%；纯化后,重组PnpC1催化邻苯二酚开环反应的最适温度45℃,最适pH5.0,Km 21.95μmol/L,Vmax 2.68μmol/（min·mg）, Fe3+、Cu2+、Fe2+、Zn2+和Co2+为激活剂,Ni2+为抑制剂。本研究为进一步分析微生物PNP降解机制奠定了基础,同时为PnpC在PNP生物酶修复领域的应用提供了必要的实验依据。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 文献综述
  • 1.1 硝基酚类化合物与环境污染
  • 1.1.1 硝基酚类化合物
  • 1.1.2 硝基酚类化合物来源与危害
  • 1.2 硝基酚类化合物污染修复
  • 1.2.1 物理化学修复
  • 1.2.2 生物修复
  • 1.3 微生物降解硝基酚类化合物研究进展
  • 1.3.1 降解硝基酚类化合物的微生物
  • 1.3.2 硝基酚化合物分解代谢
  • 1.3.3 代谢途径中的关键酶
  • 1.3.4 降解酶基因的克隆
  • 1.4 研究目的与意义
  • 第二章 重组假单胞菌PnpC1的表达纯化与催化特性研究
  • 2.1 引言
  • 2.2 实验材料
  • 2.2.1 菌株和质粒
  • 2.2.2 主要试剂与工具酶
  • 2.2.3 培养基与培养条件
  • 2.2.4 常用缓冲液
  • 2.2.5 实验仪器
  • 2.3 实验方法
  • 2.3.1 pnpC1基因的克隆
  • 2.3.2 重组质粒pMD-pnpC1的构建
  • 2.3.3 重组表达质粒pET-pnpC1的构建与鉴定
  • 2.3.4 重组PnpC1的诱导表达与SDS-PAGE分析
  • 2.3.5 重组PnpC1粗酶液的制备
  • 2.3.6 重组PnpC1蛋白浓度的测定
  • 2.3.7 重组PnpC1的活性测定
  • 2.3.8 重组PnpC1的亲和色谱纯化
  • 2.3.9 重组PnpC1的催化特性分析
  • 2.4 结果与分析
  • 2.4.1 假单胞菌HS-D38 pnpC1基因的克隆与鉴定
  • 2.4.2 HS-D38重组载体pET-pnpC1的构建与鉴定
  • 2.4.3 重组PnpC1的原核表达与SDS-PAGE分析
  • 2.4.4 亲和色谱分离纯化重组PnpC1
  • 2.4.5 重组PnpC1的催化性质
  • 2.5 讨论
  • 第三章 蜡状芽孢杆菌pnpC2/3基因的克隆表达与功能分析
  • 3.1 实验材料
  • 3.1.1 菌株和质粒
  • 3.1.2 主要试剂与工具酶
  • 3.1.3 培养基与缓冲液
  • 3.2 实验方法
  • 3.2.1 pnpC2/3基因的克隆与pET-pnpC2/3的构建
  • 3.2.2 重组PnpC2/3的诱导表达与SDS-PAGE分析
  • 3.2.3 重组PnpC2/3的活性测定
  • 3.3 结果与分析
  • 3.3.1 蜡状芽孢杆菌pnpC2/3基因的克隆与鉴定
  • 3.3.2 重组质粒pMD-pnpC2/3的构建与酶切鉴定
  • 3.3.3 重组质粒pET-pnpC2/3的构建与鉴定
  • 3.3.4 重组PnpC2/3的原核表达与SDS-PAGE分析
  • 3.3.5 重组PnpC1/2/3的活性比较
  • 3.4 讨论
  • 小结
  • 参考文献
  • 硕士期间发表论文
  • 致谢

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