纤维堆囊菌埃博霉素生物合成基因簇与酮基合酶基因的克隆与分析

纤维堆囊菌埃博霉素生物合成基因簇与酮基合酶基因的克隆与分析

论文摘要

粘细菌能够合成多种具有抗癌、抗细菌、抗真菌、免疫调节等生物学活性的天然产物。至今已经从粘细菌次级代谢物中鉴定了100种以上的基本化学结构和600多种结构衍生物,约占微生物来源总数的3.5%。而粘细菌中分离的天然产物中一半左右来自纤维堆囊菌属,并且几乎100%的纤维堆囊菌菌株都能够产生生物学活性次级代谢产物,其代谢产物的化学结构和生物活性作用机制的多样性甚至可以与著名的链霉菌类群相比拟。目前测定的模式粘细菌基因组都大于9 Mb,其中纤维堆囊菌更具有迄今为止最大的原核生物基因组(如So ce56基因组大小为12.2 Mb),大量的基因被“奢侈”地用来合成许多复杂的次级代谢产物,必将蕴藏着异常丰富的基因资源。 So0157-2是本实验室从盐水湖岸边分离鉴定的一株兼性嗜碱纤维堆囊菌,独特的自然生境使该菌株在形态发生和培养条件上均表现出一定的特殊性。前期生物学活性分析结果证实So0157-2可以产生包括埃博霉素(epothilones)在内的多种生物活性物质,为重要的药源菌。论文首先成功构建并扩增保存了纤维堆囊菌So0157-2基因组粘粒文库,获得的文库能够覆盖完整基因组至少16次,充分保证了文库的完整性,为今后筛选各种次级代谢合成、形态发生、生理分化、表达调控相关的基因或基因簇奠定了基础。 聚酮类化合物是复杂天然产物中的重要家族。广谱生物学活性使其成为商业、临床和工业上重点寻求和探讨的分子对象。它们由大型多酶复合体催化羧酸单体连续缩合而形成,该酶复合体称为聚酮合酶即PKSs(Polyketide synthases)。模块PKSs是聚酮合酶家族中的独特类群,表现出极其丰富的结构和功能。尽管粘细菌已成为次级代谢和基因组研究的新焦点,但粘细菌来源的模块聚酮化合物生物合成基因簇报道仍相对较少,通过检索仅发现14例,其中1/3的研究来自近2年内的报道。经分析发现,与放线菌来源的典型模块PKSs不同,粘细菌来源的模块聚酮化合物结构中常常存在独特的化学基团,其所对应的基因簇也存在各种新颖的组织结构模式。 在完成So0157-2基因组文库工作的基础上,本文进一步以PKSs中相对保守的酮基合酶基因(ks,β-ketoacyl-ACP synthase)制备探针,对约4000个粘粒文库克隆进行了杂交筛选,获得并保存了上百个kss阳性粘粒克隆,为资源菌So0157-2中模块PKSs基因的进一步丌发利用提供了必要条件。 埃博霉素(epothilones)是由纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)产生的模块聚酮化合物。作为极具潜力的抗癌药,埃博霉素的分子结构与生物合成特点激

论文目录

  • 目录
  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 符号说明及缩写词
  • 第一章 文献综述
  • 1.1 粘细菌简介
  • 1.1.1 粘细菌的分类地位
  • 1.1.2 粘细菌的典型特征
  • 1.1.3 粘细菌的生理学活性及其次级代谢产物
  • 1.1.4 纤维堆囊菌属及其次级代谢产物
  • 1.2 聚酮类天然产物及其生物合成特征
  • 1.2.1 聚酮类天然产物
  • 1.2.2 聚酮化合物的生物合成酶系与类型
  • 1.2.3 模块聚酮合酶及其相关基因簇特征
  • 1.3 粘细菌模块类聚酮化合物研究现状与新颖特征
  • 1.3.1 粘细菌模块类聚酮化合物研究现状
  • 1.3.2 粘细菌模块类聚酮化合物的新颖特征
  • 1.3.3 纤维堆囊菌模块类聚酮化合物研究现状
  • 1.4 埃博霉素的价值及其生物学研究现状
  • 1.4.1 埃博霉素的价值与研究进展
  • 1.4.2 埃博霉素的研究现状
  • 1.5 本文工作开展思路及研究内容
  • 第二章 纤维堆囊菌基因组粘粒文库的构建与保藏
  • 2.1 引言
  • 2.2 材料与仪器试剂
  • 2.2.1 菌株及质粒
  • 2.2.2 培养基及试剂
  • 2.2.3 主要仪器设备与耗材
  • 2.3 实验方法
  • 2.3.1 纤维堆囊菌So0157-2菌体培养与收集
  • 2.3.2 宿主细胞 XL1-Blue MR的活化与粘粒载体的扩增
  • 2.3.3 粘粒载体的处理
  • 2.3.4 高分子量基因组 DNA的制备和脉冲场凝胶电泳检测
  • 2.3.5 高分子量基因组 DNA的后续处理
  • 2.3.6 连接与包装
  • 2.3.7 效价测定与文库阳性率检测
  • 2.3.8 粘粒文库的扩增与保存
  • 2.4 实验结果与讨论
  • 2.4.1 So0157-2菌株的特征
  • 2.4.2 基因组粘粒文库的构建与质量检测
  • 2.4.3 文库的保存与杂交膜的制备
  • 2.5 本章小结
  • 第三章 埃博霉素生物合成基因簇的杂交筛选及其粘粒克隆的初步定位
  • 3.1 引言
  • 3.2 材料与仪器试剂
  • 3.2.1 菌株及质粒
  • 3.2.2 培养基及试剂
  • 3.2.3 主要仪器与设备
  • 3.2.4 分析软件及数据库
  • 3.3 实验方法
  • 3.3.1 探针的设计
  • 3.3.2 目的探针片段的克隆与测序鉴定
  • 3.3.3 探针的标记及检测
  • 3.3.4 杂交筛选条件的确立及大规模文库筛选
  • 3.3.5 阳性克隆的鉴定及定位分布
  • 3.4 实验结果与讨论
  • 3.4.1 探针的设计与克隆
  • 3.4.2 探针的标记检测与杂交筛选
  • 3.4.3 埃博霉素相关粘粒克隆的末端测序
  • 3.5 本章小结
  • 第四章 埃博霉素生物合成全基因簇的序列测定与装配
  • 4.1 引言
  • 4.2 材料与仪器试剂
  • 4.2.1 菌株及质粒
  • 4.2.2 培养基及试剂
  • 4.2.3 主要仪器设备与耗材
  • 4.2.4 软件工具及数据库
  • 4.3 实验方法
  • 4.3.1 基因簇主体部分的亚克隆测序及装配拼接
  • 4.3.2 基因簇上游序列的克隆与测序
  • 4.3.3 基因簇下游序列的亚克隆测定与装配
  • 4.3.4 埃博霉素相关序列完全装配与粘粒克隆定位
  • 4.4 实验结果与讨论
  • 4.4.1 埃博霉素阳性粘粒克隆的大量制备
  • 4.4.2 基因簇主体部分的亚克隆测序及装配
  • 4.4.3 基因簇上游序列的克隆与测序
  • 4.4.4 基因簇下游序列的测定与装配
  • 4.4.5 基因簇及其上下游序列的完全装配
  • 4.5 本章小结
  • 第五章 埃博霉素生物合成基因簇及其上下游序列的注释与分析
  • 5.1 引言
  • 5.2 材料与仪器试剂
  • 5.2.1 菌株及质粒
  • 5.2.2 培养基及试剂
  • 5.2.3 主要仪器与设备
  • 5.2.4 软件工具及数据库
  • 5.3 实验方法
  • 5.3.1 全序列 ORFs注释分析与埃博霉素阳性粘粒物理图谱绘制
  • 5.3.2 全序列启动子预测
  • 5.3.3 多个埃博霉素生物合成基因簇上游序列的克隆比对
  • 5.3.4 启动子预测与基因簇前端启动子区的功能验证
  • 5.4 实验结果与讨论
  • 5.4.1 全序列ORFs注释结果与埃博霉素粘粒物理图谱
  • 5.4.2 基因簇下游预测注释的调控蛋白ORFs分析
  • 5.4.3 三个埃博霉素生物合成基因簇及其两端序列的比较分析
  • 5.4.4 三个埃博霉素生物合成基因簇全序列启动子预测比较分析
  • 5.4.5 多个埃博霉素生物合成基因簇前端非编码区序列分析
  • 5.4.6 基因簇前端启动子的功能验证
  • 5.5 本章小结
  • 第六章 纤维堆囊菌酮基合酶基因进化多样性分析
  • 6.1 引言
  • 6.2 材料与仪器试剂
  • 6.2.1 菌株及质粒
  • 6.2.2 培养基及试剂
  • 6.2.3 主要仪器与设备
  • 6.2.4 数据库及分析软件
  • 6.3 实验方法
  • 6.3.1 染色体 DNA提取、PCR扩增及 TA连接
  • 6.3.2 电转化
  • 6.3.3 大量转化子的分析及测序
  • 6.3.4 数据检索和序列分析
  • 6.4 实验结果与讨论
  • 6.4.1 实验结果
  • 6.4.2 讨论
  • 6.5 本章小结
  • 总结与展望
  • 附录
  • 参考文献
  • 致谢
  • 攻读学位期间发表的学术论文
  • 学位论文评阅及答辩情况表
  • 相关论文文献

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