论文摘要
目的:糖尿病肾病（diabetic nephropathy, DN）是糖尿病最常见和最严重的慢性并发症之一,也是糖尿病致死的重要原因。脂肪异常升高并在肾中沉积是糖尿病肾病的主要病理因素之一。二酰基甘油酰基转移酶1（DGAT1）是脂肪合成过程的限速酶,糖尿病状态下脂肪的沉积是否与肾DGAT1的表达变化有关,未见报道。组织中脂质的含量不仅与其合成有关,还与其分解代谢的速度有关。脂肪酸的分解代谢速度又与过氧化物酶体增殖物激活受体α（peroxisome proliferator activated receptor, PPARα）的调节有关。PPARα是细胞中调节脂肪酸分解代谢的重要核转录因子。PPARα与其配体结合活化后,上调线粒体和过氧化物酶体两个细胞器中与脂肪酸分解代谢有关的下游基因的表达,加速脂肪酸的分解,降低脂肪的含量。研究报道,1型糖尿病小鼠心肌线粒体和过氧化物酶体脂肪酸β-氧化分解的限速酶,肉碱棕榈酰转移酶I（carnitine palmitoyl transferase I,CPT I）和脂酰CoA氧化酶1（acyl-CoA oxidase 1, ACOX1）基因的表达都被上调,细胞内脂肪酸的氧化供能增加。那么,是否2型糖尿病大鼠肾线粒体脂肪酸氧化的关键酶CPT I也应像小鼠心肌一样表达增加?过氧化物酶体中与脂肪酸氧化分解有关的基因,除了限速酶ACOX1、ACOX3基因外,L-双功能蛋白（L-bifunctionalprotein, LBP）、D-双功能蛋白（D-bifunctional protein, DBP）的表达如何改变?未见报道。Ghebremeskel K等利用链脲佐菌素（Streptozotocin, STZ）诱导1型糖尿病大鼠,发现肝中脂肪酸谱发生变化,花生四烯酸（C20:4）,二十二碳六烯酸（C22:6）等脂肪酸增多,那么2型糖尿病大鼠,肾脂肪酸是否也会发生变化呢?在此状态下肾过氧化物酶体参与脂肪酸β-氧化的酶基因表达如何变化呢?为了研究这些问题,我们用高脂饮食和小剂量的STZ诱导SD大鼠产生胰岛素抵抗和糖尿病出现肾功能损伤后,测定肾过氧化物酶体β-氧化的活性,线粒体和过氧化物酶体β-氧化途径相关酶PPARα、CPT I、ACOX1、ACOX3、LBP、DBP基因的表达变化以及催化脂肪酸生成甘油三酯的关键酶DGAT1基因的表达变化,测定肾游离脂肪酸和脂肪酸谱的变化,探讨过氧化物酶体脂肪酸β-氧化在糖尿病肾游离脂肪酸谱异常中所起的作用,以及肾脂肪变性形成的机制。方法:1动物分组及取材对照组喂养标准饲料,热量组成为碳水化合物占65.5%,脂肪占10.3%,蛋白质占24.2%。糖尿病组喂养高脂饲料,其中脂肪主要为猪油,热量组成为碳水化合物占20.1%,脂肪占59.8%,蛋白质占20.1%。高脂食物喂养8周,通过口服糖耐量试验（OGTT）、胰岛素敏感指数（ISI）证实胰岛素抵抗产生后一周,一次性注射小剂量STZ（27mg/kg.bw）。3天后测空腹血糖。血糖值>7.8mmol/L的大鼠,继续用高脂饲料喂养6周。6周末,各组大鼠进入代谢笼,禁食12h,收集24小时尿,用于测量尿蛋白总量。然后,60mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,颈动脉插管采血,3000rpm分离血清,用于检测血液生化指标;取出肾,迅速置于液氮中,分装后-80℃冻存,用于测定肾组织中游离脂肪酸的含量,检测脂肪沉积,过氧化物酶体β-氧化活性和提取总RNA。2光镜观察组织病理变化按常规方法将肾组织用甲醛固定、石蜡包埋、切片和HE染色,光镜观察。3血糖、血肌酐的测定应用美国生产的Olympus Au2700型全自动生化分析仪测定血糖、血肌酐。4样本蛋白质含量测定（Lowry改良法）5口服糖耐量试验（OGTT）和胰岛素敏感指数（ISI）的测定用50%葡萄糖空腹灌胃（2g/kg）,割尾出血,用血糖/血酮快速测定仪检测0,30,60,120 min血糖。分析两组大鼠血糖水平随时间的变化确定OGTT。大鼠空腹12h,眼内眦静脉丛采血,用试剂盒检测各组大鼠胰岛素水平和空腹血糖水平,参照李光伟等的方法计算ISI。ISI=ln1/（空腹血糖浓度×空腹血胰岛素浓度）。6血中甘油三酯和胰岛素的测定甘油三酯利用酶法测定,胰岛素利用放射免疫法测定。操作均按试剂盒说明书进行。7肾组织脂肪沉积的检测（油红染色）8肾组织有关基因mRNA相对表达量的测定用Trizol法提取总RNA。以β-actin作为内参,用RT-PCR法测定PPARα、CPT I、ACOX1、ACOX3、LBP、DBP、DGAT1 mRNA的相对表达量。9肾过氧化物酶体β-氧化活性测定采用分光光度法,通过软脂酰CoA氧化引起NAD+的还原来测定脂肪酸β-氧化。每分钟还原1μmol NAD+所需的酶量为1个活性单位。样品的酶活性以每毫克样品蛋白所含的酶活性毫单位数表示（mU/mg prot）。10肾组织甘油三酯的测定肾组织用异丙醇匀浆,离心取上清,用于甘油三酯测定。11肾组织总游离脂肪酸测定肾组织用生理盐水匀浆,离心取上清,用于脂肪酸测定。12肾脂肪酸百分含量的分析气相色谱仪分析肾中脂肪酸C16:0, C18, C20:0, C24:0,C26:0占肾总脂肪酸的百分含量。结果:1大鼠血、尿生化指标的改变与Con组相比,DM组大鼠空腹血糖、甘油三酯升高（P<0.01）,体重明显增高（P<0.05）,胰岛素敏感指数明显降低（P<0.05）。血肌酐、24小时尿蛋白水平都明显增高（P<0.05）。2肾形态学变化Con组肾呈深红色,表面光滑,包膜完整,与肾实质不粘连,切面皮髓质分界清晰。DM组较Con组明显增大,颜色灰暗,无光泽,表面不光滑,颗粒感明显,可见点状黄褐色脂肪变性和淤血斑,包膜不完整或粘连。切面可见皮质颜色变暗。HE染色后的组织切片显示,Con组肾组织的肾小管间质区结构清楚,肾小管上皮细胞呈方形,大小一致,排列整齐;而DM组肾组织的远端肾小管肿胀,细胞呈空泡样改变。油红染色显示Con组肾组织细胞轮廓清晰,未发现脂肪滴的存在;DM组出现大量弥漫性脂肪滴。3肾组织基因mRNA相对表达量的表达3.1 PPARαmRNA相对表达量的变化与Con组（0.11±0.01）相比,DM组肾组织PPARαmRNA的相对量（0.14±0.03） mRNA的相对含量变化无统计学意义（P>0.05）。3.2 CPT I mRNA相对表达量的变化与Con组（0.19±0.01）相比,DM组肾组织CPT I mRNA的相对量（0.34±0.02）增高（P<0.01）。3.3 ACOX1 mRNA相对表达量的变化与Con组（1.12±0.22）相比,DM组肾组织ACOX1 mRNA的相对量（1.51±0.10）明显增高（P<0.01）。3.4 ACOX3 mRNA的相对表达量的变化与Con组（0.17±0.02）相比,DM组肾组织ACOX3 mRNA的相对量（0.30±0.04）明显增高（P<0.01）。3.5 LBP mRNA的相对表达量的变化与Con组（0.25±0.02）相比,DM组肾组织的LBP mRNA的相对量（0.47±0.03）增加（P<0.01）。3.6 DBP mRNA的相对表达量的变化与Con组（0.09±0.03）相比,DM组肾组织DBP mRNA的相对量（0.21±0.02）明显增高（P<0.05）。3.7 DGAT1 mRNA的相对表达量的变化与Con组（0.13±0.01）相比,DM组肾组织的DGAT1 mRNA的相对量（0.25±0.04）增加（P<0.01）。4肾过氧化物酶体脂肪酸β-氧化活性DM组过氧化物酶体软脂酰CoAβ-氧化活性（2.12±0.37 mU/mg prot）明显高于Con组（1.13±0.27 mU/mg prot）（P<0.05）。5肾组织甘油三酯含量DM组甘油三酯含量（2.98±1.62 mmol/L）明显高于Con组（0.84±0.16 mmol/L）（P<0.05）。6肾组织总游离脂肪酸含量DM组肾游离脂肪酸（166.57±40.55μmol/g）与Con组（162.52±32.65μmol/g）比较,无统计学意义。7肾脂肪酸百分含量分析肾中十六烷酸（C16:0）、十八烯酸（C18）、二十烷酸（C20:0）、二十四烷酸（C24:0）、二十六烷酸（C26:0）占肾总脂肪酸的百分含量。DM组十六烷酸、十八烯酸、二十烷酸、二十四烷酸Con组各成分百分含量差别无统计学意义。二十六烷酸占肾总脂肪酸的（2.6±0.4）%;Con组二十六烷酸占肾总脂肪酸的（1.1±0.1）%。二十六烷酸DM组比Con组百分含量增高（P<0.05）。结论:1高脂诱导的糖尿病大鼠肾功能损伤的情况下,由于ACOX1,ACOX3,LBP,DBP的基因mRNA表达增强,肾过氧化物酶体脂肪酸氧化活性增强。2高脂诱导的糖尿病大鼠肾功能损伤的情况下,脂肪在肾中大量的沉积,与脂肪合成的限速酶DGAT1基因表达的增加有关。