斜卧青霉纤维素酶基因的初步研究

论文摘要

随着不可再生的化石能源的不断消耗,现有的以石油和煤炭为基础的传统能源将会逐渐枯竭。世界各国家为了保障自身能源供应,确保本国经济发展,先后寻找替代能源尤其是可再生性能源。纤维素是地球上最丰富的可再生性资源,占地球总生物量的40%,如果能将这种产量巨大的可再生性资源转化为人类急需的能源、食物和化工原料,对于人类社会的可持续性发展具有非常重要的意义。自然界中降解纤维素的生物绝大多数是微生物,在这些微生物中,丝状真菌具有产纤维素酶系完全,纤维素酶便于分离的优点,使产纤维素酶的真菌不仅成为理论研究的热点,而且成为工业化生产纤维素酶的工业菌株。但是纤维素酶对纤维素的降解效率低,自然界筛选到的原始菌株直接用于工业化生产成本太高,为得到高产的产纤维素酶的优良菌株,必须对原始菌株进行改造。从目前的研究结果和实际应用来看,通过理化诱变和合适的筛选策略来筛选抗阻遏的突变株,使其在相同的培养条件下比出发株分泌更多的纤维素酶,是得到纤维素酶高产菌株的最有效的方法。本实验室从土壤中筛选到一株能产分泌降解木质纤维素的完全酶系的斜卧青霉114-2。通过理化诱变得到的抗葡萄糖阻遏突变株JU-A10,能在产酶培养基上分泌大量纤维素酶,已经应用于纤维素酶和生物乙醇的工业生产中。但是对于丝状真菌的分泌纤维素酶调控机制目前研究并不是十分透彻,对于高产纤维素酶的突变株的突变机理也并不明了,这对进一步改造突变株和理性改造原始菌株带来了困难。本研究论文,从出发株和突变株的比较出发设计实验,通过蛋白质电泳、酶活测定和基因克隆几个方面,对在相同培养条件下的出发株和突变株进行比较,得出的试验数据为进一步工作奠定了基础。主要的工作包括:1通过SDS-PAGE、PAGE、胞外蛋白活性染色和比酶活的测定,比较了斜卧青霉出发株114-2和突变株JU-A10的胞外纤维素酶系产生的情况。在相同的培养条件下,突变株JU-A10的胞外蛋白的分泌量明显高于出发株114-2,用Mandels’营养盐为培养基,300ml的摇瓶培养,在以葡萄糖为碳源的情况下,114-2的胞外蛋白浓度平均达到0.11mg/ml;JU-A10的胞外蛋白浓度平均达到0.18mg/ml。在以微晶纤维素和麦麸为碳源的情况下,114-2的胞外蛋白浓度平均达到0.24mg/ml;JU-A10的胞外蛋白浓度平均达到1.10mg/ml.SDS-PAGE的蛋白电泳图谱表明在以葡萄糖为碳源时,JU-A10分泌出胞外蛋白的种类多于114-2,活性染色结果表明这些蛋白多为纤维素酶;在以微晶纤维素和麦麸为碳源的条件下,114-2和JU-A10的主要条带对应较好。PAGE电泳和活性染色表明出发株114-2和突变株JU-A10外切酶的活性染色图谱有不同,而β-葡萄糖苷酶的活性染色图谱没有变化。内切酶和木聚糖酶的活性染色图谱表明,在以微晶纤维素和麦麸为碳源的条件下,出发株114-2和突变株JU-A10的主要条带对应较好,但在相同的上样量时,活性染色结果显示出突变株JU-A10的内切酶活性高于出发株。各种纤维素酶组分的比酶活研究表明,出发株114-2和突变株JU-A10的内切酶、外切酶和滤纸酶活的比酶活变化不大,而出发株114-2的β-葡萄糖苷酶的比酶活远远大于突变株JU-A10,表明突变使突变株JU-A10的内切酶和外切酶的分泌量大大增加,但β-葡萄糖苷酶的分泌量没有变化,反应了调控机制的不同一性。2通过基因克隆,得到斜卧青霉的chh1基因,并对chh1基因的上游序列进行扩增,并比较了斜卧青霉出发株114-2和突变株JU-A10在基因序列上的差异。利用已经发表的丝状真菌的chh1基因,特别是青霉属的chh1基因,应用分子生物学软件进行同源比对,找出保守序列,设计简并引物,以斜卧青霉的基因组为模板,扩增出chh1基因的部分序列,TAIL-PCR的方法,得到chh1基因全长。用高保真的Pfu酶扩增出出发株114-2和突变株JU-A10的chh1基因序列,通过比对发现完全相同.继续利用TAIL-PCR的方法,得到出发株114-2和突变株JU-A10chh1基因上游的2kb的DNA序列,通过比对,发现有四个单个碱基发生了突变。利用RT-PCR得到chh1基因的cDNA全长,通过与chh1基因序列比较得到内含子序列。克隆的结果表明,cbh1基因全长为1500 bp,GenBank的登录号为EF397602,含有两个内含子,大小分别是75 bp和63 bp。编码453个氨基酸。同源性分析表明该cbh1基因编码的蛋白质属于糖基化水解酶第7家族。该酶同Neosartoryafischeri的CBHⅠ的同源性最高,但其蛋白质序列相似度只有75%,显示该青霉的CBHⅠ有自己独特的结构。克隆并分析了2 kb的cbh1基因上游序列,推测的转录起始位点在ATG上游91 bp处,将此设为+1。推测的TATA框在-36处。在-654、-747处存在两个代谢抑制因子CreⅠ的结合序列5’-SYGGRG-3’。瑞氏木霉纤维素酶转录调控因子ACEⅠ包含3个Cys2His2型的锌指结构,在体外与5’-AGGCA-3’的序列结合。该转录因子被认为是丝状真菌纤维素酶基因的表达抑制因子,在-1028、-1740处发现两个与其结合位点符合的序列。3 cbh1基因在毕赤酵母中的表达利用商业化的表达宿主毕赤酵母GS115和相对应的质粒pPIC9K表达外源的斜卧青霉cbh1的基因,构建的重组质粒pPIC9K-cbh1电转化毕赤酵母获得重组的毕赤酵母菌株,并诱导其分泌表达目的蛋白,经SDS-PAGE电泳得到66kDa的重组蛋白,而且可以分解底物pNPC。实验结果表明我们克隆出了正确的CBHⅠ。4 bgl1基因的克隆利用已经发表的丝状真菌的bgl1基因,特别是青霉属的bgl1基因,应用分子生物学软件进行同源比对,找出保守序列,设计简并引物,以斜卧青霉的基因组为模板,扩增出bgl1基因的部分序列,TAIL-PCR和SEFA-PCR的方法,得到bgl1基因全长。克隆的结果表明,bgl1基因全长为2963 bp,含有5个内含子。编码861个氨基酸（GenBank Accession No.EU700488）。同源性分析表明该bgl1基因编码的蛋白质属于糖基化水解酶第3家族。该酶同Thermoascus aurantiacus的BGLⅠ的同源性最高,但其蛋白质序列相似度只有72%,显示该青霉的BGLⅠ有自己独特的结构。

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摘要

ABSTRACT

第一章绪论

1.1 纤维素及纤维素酶研究

1.2 丝状真菌纤维素酶基因的克隆和纤维素酶的转录调控

1.2.1 丝状真菌纤维素酶基因的克隆

1.2.2 丝状真菌纤维素酶基因的转录调控

1.3 未知基因的克隆策略

1.3.1 TAIL-PCR的方法和原理

1.3.2 SEFA-PCR的方法和原理

1.4 本研究的主要工作和意义

第二章斜卧青霉野生株114-2和突变株JU-A10胞外纤维素降解酶系的比较

引言

2.1 材料和方法

2.1.1 菌株及培养条件

2.1.2 常用储备液及缓冲液

2.1.2.1 比酶活及菌体生长量测定相关的储备液及缓冲液

2.1.2.2 SDS-PAGE及PAGE所需储备液及缓冲液

2.1.2.3 活性染色所需储备液及缓冲液

2.1.3 试剂与仪器

2.1.4 酶活力测定

2.1.5 菌体生长量与蛋白含量测定

2.1.6 SDS-PAGE、内切葡聚糖酶及木聚糖酶的活性染色

2.1.9 PAGE及外切葡聚糖酶与β-葡萄糖苷酶的活性染色

2.2 结果与分析

2.2.1 在诱导与阻遏条件下出发株和突变株胞外纤维素酶系合成的定性比较

2.2.2 在诱导条件下出发株和突变株胞外纤维素酶系合成的定量比较

2.3 小结

第三章斜卧青霉木质纤维素酶CBH1的基因克隆及出发菌株114—2和突变菌株JU-A10 CBH1的基因序列比对

引言

3.1 材料和方法

3.1.1 菌株和培养基

3.1.2 常用储备液及缓冲液

3.1.3 试剂、工具酶与仪器

3.1.4 基因组DNA的提取与定量

3.1.5 简并引物设计与PCR扩增

3.1.6 TAIL-PCR扩增基因5'端和3'端

3.1.7 高保真扩增基因全长

3.1.8 克隆、测序与序列分析

3.1.8.1 DNA片段的回收与克隆

3.1.8.2 序列测定与分析

3.1.9 全长引物设计与PCR扩增

3.1.10 总RNA的提取及cDNA的合成

3.2 结果与分析

3.2.1 基因组DNA的质量

3.2.2 斜卧青霉cbh1基因的克隆及序列分析

3.2.2.1 斜卧青霉cbh1基因片段的克隆

3.2.2.2 TAIL-PCR扩增cbh1基因5'端和3'端序列

3.2.2.3 TAIL-PCR扩增cbh1基因3'端序列

3.2.2.4 cbh1全长基因的克隆

3.2.2.5 RT-PCR扩增cbh1 cDNA

3.2.2.6 cbh1上游序列的扩增

3.3 小结

第四章斜卧青霉CBH1基因在毕赤酵母中表达

引言

4.1 实验材料

4.1.1 菌株和质粒

4.1.2 分子克隆用酶和试剂及仪器

4.1.3 培养基和溶液

4.2 实验方法

4.2.1 菌种的活化培养

4.2.2 pUC19-cbh1质粒的提取

4.2.3 目的基因cbh1的PCR扩增

4.2.4 重组质粒pPIC9K-cbh1的构建

4.2.4.1 载体质粒pPIC9K的提取

4.2.4.2 目的基因与载体的限制性内切酶消化反应

4.2.4.3 线状载体质粒pPIC9K的去磷酸化处理

4.2.4.4 目的基因与载体的连接反应

4.2.5 大肠杆菌转化

4.2.5.1 大肠杆菌超级感受态细胞的制备

4.2.5.2 目的片段转化大肠杆菌

4.2.5.3 大肠杆菌转化子的验证

4.2.6 重组质粒与毕赤酵母基因组的同源整合

4.2.6.1 重组质粒的线性化

4.2.6.2 毕赤酵母电转化

4.2.7 酵母基因组DNA的简易高效提法

4.2.8 外源蛋白在毕赤酵母中的表达与检测

4.2.8.1 外源蛋白的诱导表达

4.2.8.2 胞外蛋白表达情况的SDS-PAGE检测

4.2.8.3 酶活性测定

4.3 实验结果

4.3.1 目的基因cbh1的PCR引物设计

4.3.2 重组质粒pPIC9K-cbh1的构建

4.3.3 目的基因cbh1的PCR扩增

4.3.4 载体质粒与目的基因的酶切、连接

4.3.5 连接液转化大肠杆菌感受态细胞及转化子的筛选

4.3.5.1 连接液转化大肠杆菌感受态细胞

4.3.5.2 转化子的验证

4.3.6 毕赤酵母电转化及重组酵母菌的筛选

4.3.6.1 毕赤酵母电转化

4.3.6.2 酵母转化子的PCR鉴定

4.3.7 SDS-PAGE检测工程菌表达目的蛋白的结果

4.3.7.1 粗酶液的制备

4.3.7.2 酵母重组子表达rCBH I酶活测定

4.4 小结

第五章斜卧青霉β-葡萄糖苷酶基因的克隆

引言

5.1 材料和方法

5.1.1 菌株和培养基

5.1.2 常用储备液及缓冲液

5.1.3 试剂、工具酶与仪器

5.1.4 基因组DNA的提取与定量

5.1.5 简并引物设计与PCR扩增

5.1.6 TAIL-PCR扩增基因5'端和3'端

5.1.7 SEFA-PCR扩增基因

5.1.8 高保真扩增基因全长

5.1.9 克隆、测序与序列分析

5.1.9.1 DNA片段的回收与克隆

5.1.9.2 序列测定与分析

5.1.10 总RNA的提取及cDNA的合成

5.2 结果与分析

5.2.1 斜卧青霉bgl1基因片段的克隆

5.2.2 TAIL-PCR扩增bgl1基因5'端和3'端序列

5.2.3 TAIL-PCR扩增bgl1基因5'端序列

5.2.4 用SEFA-PCR扩增bgl1 3'端序列

5.2.5 bgl1全长基因的克隆和cDNA克隆

全文总结

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

斜卧青霉纤维素酶基因的初步研究

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