论文摘要
目的研究Genistein和Doxorubicin对人骨髓瘤细胞株XG-1和RPMI8226的增殖的影响;研究Genistein对人骨髓瘤细胞株RPMI8226凋亡的影响;研究Genistein和Doxorubicin对人骨髓瘤基质细胞的增殖的影响;研究Genistein和Doxorubicin对人骨髓瘤细胞株及人骨髓瘤基质细胞NF-κB表达的影响;检测Genistein处理前后人骨髓瘤基质细胞的IL-6、bcl-xl、cyclinD1、ICAM-1、bcl-2的基因表达;检测Genistein处理前后人骨髓瘤细胞株RPMI8226、XG-1的bcl-xl、cyclinD1、ICAM-1、bcl-2的基因表达;检测Genistein处理前后XG-1细胞内Akt和磷酸化Akt的表达;观察Genistein处理人骨髓瘤基质细胞后对骨髓瘤细胞株XG-1生长的影响。方法四唑盐比色法观察Genistein对人骨髓瘤细胞株RPMI8226、XG-1和人骨髓瘤基质细胞的生长抑制作用,流式细胞术检测Genistein诱导人骨髓瘤细胞株RPMI8226的凋亡;半定量RT-PCR检测Genistein处理前后人骨髓瘤基质细胞的IL-6、bcl-xl、cyclinD1、ICAM-1、bcl-2的表达;检测Genistein处理前后RPMI8226、XG-1细胞的bcl-xl、cyclinD1、ICAM-1、bcl-2基因的表达;免疫细胞化学染色检测Genistein处理前后NF-κB在RPMI8226、XG-1细胞内的表达分布;凝胶电泳迁移率试验检测Genistein处理前后NF-κB在人骨髓瘤细胞株RPMI8226、XG-1和人骨髓瘤基质细胞核内的表达水平;Western blot检测Genistein处理前后人骨髓瘤细胞株XG-1细胞内Akt和磷酸化Akt的表达;IL-6依赖骨髓瘤细胞株XG-1与人骨髓瘤基质细胞共同培养构建体外生长模型。IL-6依赖骨髓瘤细胞株XG-1脱离IL-6培养24小时后,接种于四种不同的培养基中,分别为应用Genistein处理的骨髓瘤患者的基质细胞上清液;正常骨髓瘤患者的基质细胞上清液;rIL-6（1ng/ml）的RPMI1640培养基;普通RPMI1640培养基。培养72小时,每24小时时间点从培养孔中吸取等量XG-1细胞进行MTT试验。结果Genistein对人骨髓瘤细胞株RPMI8226、XG-1和人骨髓瘤基质细胞有生长抑制作用,Genistein对XG-1细胞增殖的影响72小时IC50=8μg/ml,Genistein对RPMI8226细胞增殖的影响72小时IC50=15μg/ml,Genistein对骨髓瘤基质细胞增殖的影响72小时IC50=10μg/ml,随着干预因素浓度的不断增加,细胞活力逐渐下降,随着干预因素作用时间的不断增加,细胞活力也逐渐下降,Genistein对骨髓瘤细胞和骨髓瘤基质细胞的抑制作用不如Doxorubicin强烈,起效时间也较晚,Genistein和Doxorubicin联和应用抗细胞增殖效果明显提高,优于单药应用的效果。不同浓度的Genistein作用RPMI8226细胞72小时后流式细胞术检测凋亡的结果,随着处理因素的浓度逐渐升高,细胞凋亡峰逐渐升高,呈剂量依赖。Genistein处理后人骨髓瘤基质细胞的IL-6、bcl-xl、cyclinD1、ICAM-1、bcl-2的表达下调;Genistein处理后RPMI8226、XG-1细胞的bcl-xl、cyclinD1、ICAM-1、bcl-2基因的表达下调;伴随Genistein处理浓度逐渐增加,人骨髓瘤基质细胞的bcl-2、bcl-xl、CyclinD1、ICMA-1、IL-6基因mRNA的表达逐渐下降;伴随Genistein处理浓度逐渐增加,RPMI8226、XG-1细胞的bcl-2、bcl-xl、CyclinD1、ICMA-1基因mRNA的表达逐渐下降,且有明确的剂量依赖。免疫细胞化学染色检测Genistein处理前NF-κB在RPMI8226、XG-1细胞浆、核内的均有表达;Genistein处理后NF-κB在细胞浆有表达;核内的表达下降;10μg/mlGenistein作用XG-1细胞24小时后免疫细胞化学检测NF-κB在细胞内的表达分布,可见Genistein处理后部分细胞NF-κB在细胞质表达、核内低表达。15μg/mlGenistein作用RPMI8226细胞24小时后免疫细胞化学检测NF-κB在细胞内的表达分布,可见Genistein处理后部分细胞NF-κB在细胞质表达、核内低表达。不同浓度的Genistein和Doxorubicin作用XG-1细胞24小时后由凝胶电泳迁移率试验检测NF-κB的活力。随着处理因素的浓度逐渐提高,细胞核内NF-κB的活力逐渐下降,呈剂量依赖。小剂量的Doxorubicin明显提升细胞内的NF-κB活力,而Genistein则能明显逆转这一作用。不同浓度Genistein和Doxorubicin处理RPMI8226细胞24小时后,由凝胶电泳迁移率试验检测NF-κB活力。小剂量的Doxorubicin对细胞内的NF-κB活力影响不大,而Genistein则能明显增强对细胞内NF-κB活力的抑制。骨髓瘤基质细胞和正常骨髓基质细胞应用15μg/ml的Genistein作用24小时后由凝胶电泳迁移率试验检测NF-κB的活力。可见骨髓瘤基质细胞的NF-κB的活力明显强于正常骨髓基质细胞的NF-κB的活力,Genistein能够明显降低骨髓瘤基质细胞的NF-κB的活力,而对正常骨髓基质细胞的NF-κB的活力无明显影响。XG-1细胞用不同浓度Genistein处理24小时,由western blot检测Genistein对Akt和磷酸化Akt的影响。可见Genistein作用XG-1细胞后Akt无明显变化,而磷酸化Akt随着处理因素的浓度逐渐提高,表达逐渐下降,呈剂量依赖。IL-6依赖骨髓瘤细胞株XG-1脱离IL-6与基质细胞培养构建体外生长模型;结果可见IL-6饥饿的XG-1细胞在rIL-6（1 ng/ml）的RPMI1640培养基可迅速恢复增殖;在正常骨髓瘤患者的基质细胞上清液中也可以恢复增殖,但速度和恢复的程度稍差;在应用Genistein处理的骨髓瘤患者的基质细胞上清液中XG-1细胞无法恢复增殖,细胞活力大幅下降;在普通的RPMI1640培养基中XG-1细胞也无法恢复增殖,细胞活力下降幅度更大。结论NF-κB在RPMI8226、XG-1人类骨髓瘤细胞株和骨髓瘤患者的基质细胞中持续激活,Genistein下调NF-κB的激活形式而且抑制了Akt磷酸化,下调NF-κB调控基因bcl-2,bcl-xL,cyclin D1,IL-6和ICAM-1,进而诱导了细胞凋亡和抑制细胞增殖。Genistein抑制细胞的NF-κB的激活部分经由Akt通路完成。Genistein可通过影响骨髓瘤的基质细胞的生长而使骨髓瘤细胞的生长受到抑制。