草鱼野生和养殖群体间遗传结构比较研究

论文摘要

草鱼（Ctenopharyngodon idella）属于鲤形目（Cypriniformes），鲤科（Cyprinidae），雅罗鱼亚科（Leuciscinae），因其草食性、生长快、肉质鲜美等特点，是优良的淡水养殖品种。由于人工繁殖的成功应用，改善了种苗供应不足的状况，也使很多地方引种后建立了独自的繁殖小群体。受生产条件和生产规模的限制，生产单位保存的亲鱼数量不多，且大部分选自自繁后代，如此经过多年的生殖隔离和多代近交，引起了养殖性状不同程度的退化，如性早熟、成熟个体趋小、抗病力降低等。 在群体遗传学的研究中，利用不同DNA标记在不同群体出现的频率，预测群体间的遗传分化已成为一个热门研究课题。但在草鱼的研究中，尚未见用不同分子标记各等位基因出现频率的差异，研究野生和养殖草鱼种质资源的报道。由于养殖性状的退化和稀有等位基因的丢失以及杂合度的降低密切相关，因此应用大量DNA标记研究人工繁殖条件下，草鱼由于近交产生的杂合度下降和不利突变的积累是一条可行的途径。 本文利用磁珠富集法对草鱼微卫星进行了筛选，然后运用微卫星（microsatellite or simple sequence length polymorphism）重复序列长度多态、TRAP（target region amplified polymorphism）靶位区域扩增多态、SRAP（sequence-related amplified polymorphism）序列相关扩增多态等标记，从基因组重复序列、表达序列标签以及开放阅读框等不同角度，通过比较草鱼野生群体和养殖群体间等位基因频率的变化，从分子水平揭示养殖群体遗传物质的变化，从而为解决养殖性状的退化提供理论依据，也为将来草鱼遗传图谱构建提供更多的遗传标记。具体研究内容如下： 1 草鱼基因组提取及CA重复微卫星富集文库的构建 利用传统酚-氯仿法及试剂盒法对草鱼血液及鳍条基因组提取效果进行比较，结果发现：以血液为试验材料，传统方法抽提效果好于试剂盒法，可能是由于购买的试剂盒适合人血液基因组的缘故；采用传统方法提取草鱼基因组时，血液提取效果好于鳍条。根据生物素（biotin）与链亲和素（strcptavidin）的强亲和性原理，用平端限制性内切酶Mbo Ⅰ消化草鱼基因组DNA，回收纯化300-1000bp的片段，连接上接头，与生物素标记的微卫星寡核苷酸探针（CA）16退火结合，用链亲和素磁珠（streptavidin magnetic beads）亲和捕捉，获得含有微卫星序列的单链目的片段，经PCR扩增形成双链，然后克隆到pMD18-T载体上，转化至DH5α中，首次成功构建草鱼基因组微卫星富集文库。抽样检测阳性率为69.23％，说明构建的富集文库质量较高，适合大规模测

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号及缩写汇总
• 引言
• 第一部分 文献综述
• 第一章 水产养殖现状及草鱼养殖中存在的问题
• 1 水产养殖现状及在国民经济中的地位
• 1.1 我国是世界淡水渔业的龙头
• 1.2 发展淡水渔业是稳定我国粮食安全的重要举措
• 1.3 发展淡水渔业是构建我国健康食品和安全食品体系的重要环节
• 2 淡水渔业存在的问题
• 2.1 鱼类多样性迫切需要保护
• 2.2 水产种质资源衰退现象严重
• 3 草鱼生物学特性
• 3.1 分类地位
• 3.2 形态特征
• 3.3 生活习性
• 4 草鱼养殖状况及存在的问题
• 5 草鱼遗传多样性研究现状
• 5.1 生化遗传分析
• 5.2 分子遗传变异分析
• 参考文献
• 第二章 群体遗传学及其研究方法
• 1 群体遗传学的概念及其应用
• 1.1 物种及种群的概念
• 1.2 群体遗传学的概念及研究内容
• 1.3 群体遗传学的应用
• 1.3.1 群体的判别和遗传分化
• 1.3.2 有效群体的确定
• 1.3.3 杂合度的评估
• 1.3.4 渔业管理和资源利用
• 1.3.5 保护生物学
• 2 群体遗传学研究中的分子方法
• 2.1 DNA分子标记的种类及原理
• 2.1.1 微卫星DNA标记（Microsatellite DNA）
• 2.1.2 简单重复序列间扩增（Inter-Simple Sequence Repeats ISSR）
• 2.1.3 随机扩增多态性DNA（RAPD）
• 2.1.4 扩增片段长度多态（Amplified Fragment Length Polymorphism,AFLP）
• 2.1.5 序列相关扩增多态（sequence-related amplified polymorphism,SRAP）
• 2.1.6 靶位区域扩增多态性（target region amplified polymorphism,TRAP）
• 2.2 分子标记技术与生物多样性保护
• 2.3 分子标记技术的发展前景
• 2.4 分子标记技术在比较水产生物野生和养殖群体遗传多样性的应用
• 3 养殖群体的近交生物学效应
• 4 有效繁殖群体的概念及应用
• 参考文献
• 第三章 微卫星标记在水产养殖上的应用
• 1 微卫星的概念及其发展历史
• 2 微卫星分子标记的特点及类型
• 2.1 特点
• 2.2 分类
• 3 微卫星DNA标记的分离和筛选
• 4.微卫星分子标记国内外研究现状及在水产养殖中应用前景
• 4.1 遗传图谱的构建
• 4.2 群体遗传结构及生物多样性分析
• 4.3 家系分析及亲子鉴定
• 4.4 QTL（quantitative trait loci）定位及标记辅助育种
• 4.5 养殖群体和野生群体遗传差异的研究
• 参考文献
• 第二部分 论文实验部分
• 第一章 草鱼基因组提取及（CA）重复微卫星富集文库的构建
• 1.实验材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 引物合成
• 1.2.1 接头序列
• 1.2.2 生物素标记探针
• 1.3 菌株、载体
• 1.4 试剂盒及药品
• 1.5 主要仪器
• 2.实验方法
• 2.1 草鱼基因组DNA的提取
• 2.1.1 草鱼血液DNA的提取（传统酚仿抽提）
• 2.1.2 草鱼鳍条DNA的提取（传统酚仿抽提）
• 2.1.3 试剂盒抽提草鱼血液基因组
• 2.1.4 琼脂糖凝胶电泳
• 2.2 草鱼基因组微卫星富集文库的构建
• 2.2.1 草鱼基因组DNA的酶切
• 2.2.2 酶切片段的回收纯化（用Genl Extraction Kit回收试剂盒）
• 2.2.3 酶切片段和接头的连接
• 2.2.4 亲和捕捉
• 2.2.5 克隆富集的微卫星DNA片段
• 2.2.6 氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞
• 2.2.7 连接产物的转化
• 2.2.8 重组质粒的筛选
• 2.2.9 保菌
• 2.2.10 质粒DNA的提取（碱裂解法）
• 2.3 微卫星富集文库的抽样鉴定
• 3.结果与分析
• 3.1 基因组DNA提取的效果
• 3.2 草鱼基因组酶切
• 3.3 酶切片段与接头的连接
• 3.4 亲和捕捉
• 3.5 富集文库的抽样鉴定
• 4 讨论
• 4.1 影响基因组提取效果的因素
• 4.2 酶切片段的最佳大小
• 4.3 草鱼微卫星富集文库
• 参考文献
• 第二章 草鱼野生和养殖群体间遗传变异的微卫星分析
• 1 材料和方法
• 1.1 样品来源
• 1.2 基因组DNA提取
• 1.3 SSR引物序列
• 1.4 PCR反应体系及反应程序
• 1.5 扩增产物的检测
• 1.5.1 准备制胶玻璃板
• 1.5.2 配制聚丙烯酰胺凝胶
• 1.5.3 预电泳
• 1.5.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 1.5.5 银染
• 1.6 数据统计与分析
• 2 结果与分析
• 2.1 微卫星PCR扩增结果及等位基因频率的计算
• 2.2 3个草鱼群体内遗传变异分析
• 2.3 3个草鱼群体间遗传分化
• 3 讨论
• 3.1 微卫星标记的选择
• 3.2 草鱼野生和养殖群体内及群体间的遗传分化
• 参考文献
• 第三章 草鱼TRAP-PCR反应体系的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 实验材料
• 1.1.2 试剂
• 1.1.3 仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 DNA的提取
• 1.2.2 PCR扩增程序选择
• 1.2.3 TRAP-PCR反应参数的优化
• 1.2.4 TRAP产物的检测
• 2 结果与分析
• 2.1 模板DNA浓度的确定
• 2.2 最适Mg2+浓度的确定
• 2.3 dNTPs浓度
• 2.4 引物浓度
• 2.5 退火温度
• 3 讨论
• 参考文献
• 第四章 TRAP及SSCP检测草鱼微卫星及相关序列多态性
• 1 材料与方法
• 1.1 材料来源
• 1.2 DNA的提取
• 1.3 引物序列
• 1.4.1 SSCP不对称PCR扩增
• 1.4.2 TRAP-PCR扩增
• 1.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
• 2 结果
• 2.1 微卫星引物扩增结果
• 2.2 TRAP引物与微卫星标记引物组合对草鱼基因组扩增结果
• 2.3 SSCP分型结果
• 3 讨论
• 3.1 微卫星扩增存在的问题
• 3.2 与新型标记结合解决多态性不足的问题
• 3.3 新型分子标记TRAP在水产养殖动物草鱼中适用性探讨
• 3.4 SSCP在检测草鱼微卫星构象多态方面的引用
• 参考文献
• 第五章 不同群体草鱼遗传结构的TRAP分析
• 1 材料和方法
• 1.1 材料来源
• 1.2 基因组DNA提取
• 1.3 TRAP反应流程
• 1.3.1 TRAP引物
• 1.3.2 TRAP-PCR扩增
• 1.3.3 电泳分析
• 1.4 数据处理
• 1.5 野生群体特有或养殖群体基因频率下降明显位点的回收
• 1.6 二次PCR扩增
• 1.7 克隆测序
• 2 结果
• 2.1 不同TRAP引物组合对草鱼3群体的扩增结果
• 2.2 草鱼3群体间的遗传相似系数及遗传距离
• 2.3 草鱼不同群体各位点基因频率的比较
• 2.3 草鱼野生群体特有或养殖群体基因频率下降明显的位点回收测序
• 3 讨论
• 参考文献
• 第六章 新型标记SRAP在草鱼遗传多样性评价的适用性分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料来源
• 1.2 基因组DNA提取
• 1.3 SRAP引物序列
• 1.4 电泳分析
• 1.5 数据处理
• 1.6 野生群体特有或养殖群体基因频率下降明显位点的回收、二次扩增、克隆测序
• 2 结果
• 2.1 引物筛选
• 2.2 不同引物组合对草鱼3群体的扩增结果
• 2.3 草鱼不同群体扩增位点显性基因型频率的分布规律
• 2.4 3群体遗传相似系数及遗传距离的计算
• 2.5 野生群体特有或基因频率下降明显的条带测序结果
• 3 讨论
• 3.1 新型标记SRAP原理及其应用
• 3.2 草鱼野生及养殖群体间遗传分化
• 参考文献
• 附录：实验试剂及配置
• 攻读学位期间发表论文目录
• 致谢