通用型禽流感病毒胶体金免疫层析诊断方法的建立

论文摘要

本研究采用胶体金颗粒标记实验室已有的针对M蛋白单克隆抗体,以多克隆抗体(禽流感病毒的羊血清)作为检测线捕获抗体,以兔抗鼠二抗为质控线捕获抗体,应用免疫层析原理建立了检测通用型禽流感病毒的双抗体夹心胶体金免疫层析方法。通过对各个反应条件进行优化,获得了最佳工作条件,包括:制备100mL体系的35nm稳定、均匀、呈单一分散状态的胶体金颗粒;0.2M单克隆抗体标记浓度;胶体金与单克隆抗体标记的最适pH在单克隆抗体的等电点或略高于等电点;胶体金与0.1M单克隆抗体标记的最适浓度是100:8;辛酸硫酸铵法纯化标记用的M单克隆抗体和羊多抗浓度分别是1.0mg/mL、9.6mg/mL。以上实验结果为禽流感病毒的研究,禽流感快速诊断方法的建立奠定基础。用建立的双抗体夹心胶体金免疫层析方法组装的试纸条,只需要将试纸条插入待检样品,5min后观察结果。试纸条上检测线和质控线同时出现两条红线为阳性,只在质控线出现一条红线的为阴性。对已知的新城疫病毒(NDV)、禽痘病毒(APV)、马立克氏病毒(MDV)、鸡产蛋下降综合症病毒(EDSV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、禽流感病毒H1～H15亚型阳性病毒(鸡胚尿囊液)、蒸馏水、尿囊液和空白对照进行交叉反应性试验,结果表明:基于单抗的通用型禽流感病毒双抗体夹心胶体金免疫层析方法和其他禽类病毒没有明显的交叉反应性,与禽流感各个亚型病毒反应呈阳性,说明该方法对所有亚型流感病毒具有较高的特异性。将血凝价为1:1024的H5N1、H7N7和H9N2亚型禽流感病毒阳性鸡胚尿囊液倍比稀释,与HA相比,本实验建立的双抗体夹心胶体金免疫层析方法能检测出血凝价在1:16以上的H5N1病毒,能检测出血凝价在1:8以上的H7N7病毒,能检测出血凝价在1:16以上的H9N2病毒。随机取出不同批次和批间的试纸条,进行H5N1病毒重复性试验,检测结果显示保存3个月之内试纸条效果良好,无特异性产生。保存期结果表明:试验中制备好的金标抗体密封闭光4℃冰箱保存,金标垫(喷涂过金标抗体的玻璃纤维素膜)密封加干燥剂闭光4℃冰箱保存,制备优良的金标抗体在4℃冰箱保存6个月以上效果良好;金标垫在4℃冰箱保存6个月以上释放量能保持在80%以上。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 禽流感病毒（AIV）简介
• 1.1.1 AIV 形态结构
• 1.1.2 AIV 生物学特性
• 1.1.3 HA、NA 和M 基因结构及其编码蛋白的功能
• 1.2 HPAI 的危害及公共卫生学意义
• 1.2.1 HPAI 给养禽业造成的危害
• 1.2.2 与人流感相关的禽流感事件
• 1.2.3 产生导致人流感大流行病毒株的可能机制
• 1.3 禽流感的诊断方法及研究进展
• 1.3.1 病原学诊断
• 1.3.2 血清学诊断
• 1.3.3 分子生物学诊断
• 1.4 本研究的目的和意义
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 病毒
• 2.1.2 单抗及羊多克隆抗体
• 2.1.3 实验动物
• 2.1.4 实验用阴阳性对照抗原
• 2.1.5 主要仪器设备及耗材
• 2.1.6 主要试剂和溶液
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 胶体金颗粒的制备
• 2.2.2 兔抗鼠抗体的制备
• 2.2.3 单克隆抗体和多克隆抗体的辛酸硫酸铵法纯化及纯度测定
• 2.2.4 金标单克隆抗体的制备
• 2.2.5 胶体金免疫层析方法的建立
• 2.2.6 特异性初步试验
• 2.2.7 敏感性初步试验
• 2.2.8 重复性初步试验
• 2.2.9 待组装试剂盒中部分组成成分的保存期试验
• 3 实验结果
• 3.1 金标抗体的制备研究结果
• 3.1.1 胶体金颗粒大小的确定
• 3.1.2 抗体的纯化后浓度确定
• 3.1.3 单克隆抗体与胶体金结合最佳PH 确定
• 3.1.4 单克隆抗体与胶体金结合最小蛋白浓度的确定
• 3.1.5 抗体标记过程中缓冲液的选择
• 3.1.6 抗体标记过程中封闭液的选择
• 3.1.7 抗体标记过程中洗涤液的选择
• 3.1.8 抗体保存液的选择
• 3.1.9 最适合反应时间的确定
• 3.1.10 金标抗体的纯化
• 3.1.11 金标抗体的保存
• 3.2 试纸条组成部分的确定
• 3.2.1 样品垫及其处理液的确定
• 3.2.2 结合垫及其处理液的确定
• 3.2.3 硝酸纤维素膜的确定
• 3.2.4 金标抗体、捕获抗体、对照抗体最适喷涂量的确定
• 3.2.5 对照抗体、捕获抗体固定在硝酸纤维素膜上的确定
• 3.2.6 硝酸纤维素膜的封闭
• 3.3 试纸条的组装及测试
• 3.3.1 环境湿度实验
• 3.3.2 试剂条组成部分干燥工艺
• 3.3.3 特异性初步实验结果
• 3.3.4 敏感性初步实验结果
• 3.3.5 重复性初步实验结果
• 3.3.6 试剂盒中部分组成成分的保存期试验
• 4 讨论
• 4.1 胶体金层析技术在禽流感病毒诊断的可行性应用
• 4.1.1 技术基础
• 4.1.2 可行性
• 4.1.3 应用前景
• 4.2 影响胶体金免疫层析试纸条条件的优化
• 4.2.1 胶体金颗粒炼制条件对试纸条的影响
• 4.2.2 金标抗体标记条件对试纸条的影响
• 4.2.3 样品垫和结合垫处理条件对试纸条的影响
• 4.2.4 胶体金免疫层析试纸条的优化
• 4.2.5 抗原裂解液的选择
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士期间发表的学术论文