Itk分子在T淋巴细胞活化过程中的作用机制研究

论文摘要

在免疫细胞信号传导通路中,Src,Syk/ZAP-70和Tec三个PTK家族参与了T细胞活化的信号转导过程。Itk属于非受体型酪氨酸激酶Tec家族成员之一,它特异性地表达于T细胞系,参与了T细胞活化的信号转导过程,其酪氨酸磷酸化以及与其它信号分子SLP76和PLC-γ1之间的相互作用,在T淋巴细胞信号转导及细胞活化过程中起着重要的作用。但目前对Itk在T细胞信号传导中的具体作用机理还不十分明确。本论文的研究目的是探索Itk对T淋巴细胞信号通路的影响。研究主要是通过两方面的工作来进行。一方面是通过对Itk的SH2结构域和SH3结构域进行定点突变,以293T细胞为模型,利用免疫共沉淀技术来研究Itk的突变体是否会影响Itk与SLP76的结合,从而影响Itk下游PLC-γ1信号通路；另一方面以Jurkat细胞为研究模型,探讨甲型H1N1流感病毒感染T细胞后对Itk信号通路的影响。首先,通过免疫共沉淀及免疫印迹实验发现Itk的七个突变体可以和SLP76相互作用,其中Itk T279D.Itk W208K.Itk Y292A三个突变体会影响Itk与SLP76的结合；同时研究结果表明,在没有SLP76参与的情况下,Itk突变体也能直接与PLC-γ1相互作用,但是不能削弱Itk与PLC-γ1之间的结合,其中Itk的四个突变体T279D、W208K、C288A、Y292A会显著降低PLC-γ1 Y775和Y783两个位点的磷酸化水平,影响Itk下游PLC-γ1信号通路。其次,我们用甲型H1N1流感病毒感染T细胞,研究发现：流感病毒感染Jurkat细胞后,细胞内源性Itk由细胞质向细胞膜迁移,Itk下游蛋白PLC-γ1蛋白的表达水平无明显变化,而PLC-γ1 Y775和Y783两个位点的磷酸化水平随病毒感染时间的延长而逐渐升高,表明在甲型流感病毒感染Jurkat细胞的过程中,Itk/PLC-γ1信号通路被逐渐激活；应用shRNA技术干扰Jurkat细胞中的Itk表达,发现敲低Itk表达后,PLC-γ1 Y775的磷酸化水平在感染后无明显变化,而PLC-γ1 Y783的磷酸化水平在感染后随时间延长而降低。实验结果提示,甲型流感病毒感染Jurkat细胞后可能通过改变Itk/PLC-γ1信号通路的活性,从而影响T细胞的活化。本研究为甲型流感病毒感染的免疫保护机理提供新线索,同时对Itk.SLP76及PLC-γ1三者之间相互作用的研究,也有助于我们深入了解T细胞活化的分子调控机制。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 文献综述
• 第一章 Itk分子信号通路的研究进展
• 1. Itk及其基本结构
• 2. Itk、SLP76及PLC-γ1之间的相互作用
• 3. Itk对T细胞功能的影响
• 第二章 甲型流感病毒的研究进展
• 1. 流感概述
• 2. 流感病毒感染对宿主信号通路的影响
• 第二部分 实验部分
• 第三章 Itk分子突变影响T细胞信号通路机制的研究
• 引言
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 实验方法
• 2. 结果与分析
• 2.1 真核表达质粒（Itk、SLP76和PLC-γ1）构建
• 2.2 Itk突变体与SLP76之间的相互作用
• 2.3 Itk突变体对PLC-γ1磷酸化水平的影响
• 2.4 Itk突变体与PLC-γ1之间的相互作用
• 2.5 Itk突变体与PLC-γ1共转染对PLC-γ1磷酸化的影响
• 3. 讨论
• 4. 本章小结
• 第四章 甲型流感病毒感染对Jurkat细胞Itk信号通路的影响
• 引言
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 实验方法
• 2. 结果与分析
• 2.1 甲型流感病毒可以直接感染Jurkat细胞
• 2.2 甲型流感病毒感染Jurkat细胞后影响内源Itk的分布
• 2.3 流感病毒感染Jurkat细胞影响Itk下游信号分子PLC-γ1的磷酸化水平
• 2.4 干扰Itk表达对病毒感染的Jurkat细胞PLC-γ1磷酸化的影响
• 3. 讨论
• 4. 本章小结
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 硕士期间发表论文