高产葡萄糖异构酶菌种的筛选及酶学性质研究

论文摘要

葡萄糖异构酶是一种能够催化D-葡萄糖和D-木糖分别生成D-果糖和D-木酮糖的微生物酶,是由淀粉大规模制备果葡糖浆生产工艺中的关键性酶。随着食品工业的不断发展,传统糖源已远不能满足生产需要,各国研究者不断地寻找新的来源。以葡萄糖异构酶异构化生产果葡糖浆先后在日本和美国发展起来,因此葡萄糖异构酶逐渐成为最重要的工业用酶,越来越受到人们的重视。土壤是微生物的大本营,本文的研究目的是从土壤中筛选一株产胞外葡萄糖异构酶的菌株,优化产酶条件,分离纯化该葡萄糖异构酶,并研究其酶学性质,为寻找一种新的葡萄糖异构酶奠定基础。通过初筛共得到产葡萄糖异构酶细菌38株,放线菌12株,从其中进一步复筛得到一株具有高产胞外葡萄糖异构酶能力的放线菌S8,经菌落和个体形态观察初步判断为链霉菌,编号为TCCC 11564。通过单因素及正交试验设计确定了链霉菌TCCC 11564摇瓶发酵产葡萄糖异构酶的最佳培养基为玉米浆培养基中添加麦芽糖12g/L,蛋白胨5g/L,硫酸镁0.6g/L；在此基础上对发酵条件进行了优化,优化后的最佳发酵条件为装液量20 mL／250 mL初始pH 8.2、30℃、180 r／min摇瓶发酵48h,在此条件下得到的发酵液酶活最高达到520.6U／mL,比优化前的116.08 U／mL提高了4.48倍。葡萄糖异构酶的提取采用硫酸铵分级沉淀法,收集40%-100%的沉淀物,其酶比活力达528.63±4.85U／mg,活力回收率为91.26±4.45%。使用DEAE-52和SephadexG-150纯化后葡萄糖异构酶比活力分别达1965.15±30 U／mg和3625.37±50U／mg,回收率分别为48.25±1.86%和20.97±1.98%,经SDS-PAGE验证得到了较纯的葡萄糖异构酶,并测得其亚基分子量约为44.0 kDa。酶学性质研究结果表明,链霉菌TCCC 11564葡萄糖异构酶最适反应温度为70-75℃,90℃保温120 min后酶活几乎完全丧失。pH为7.8-8.5之间具有较好的稳定性,pH在7.5以下时,稳定性下降,在pH为6.5时酶活损失50%以上,反应的最适pH是8.0。Mg2+、Co2+对葡萄糖异构酶酶活力有明显的促进作用,Ca2+、Fe3+、A13+则有较强的抑制作用。其Km值为0.51 mol/L。在70℃下,底物葡萄糖浓度为10%（W/V）时,葡萄糖异构化率最高达54.8%。利用大孔树脂D201对该菌株发酵产的粗酶液进行了简单固定化,固定化葡萄糖异构酶活力达3541.7U／g,对发酵液中粗酶的回收率达82.75%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 葡萄糖异构酶简介
• 1.1.1 葡萄糖异构酶的结构
• 1.1.2 葡萄糖异构酶的性质
• 1.1.3 葡萄糖异构酶的应用
• 1.1.4 葡萄糖异构酶的来源
• 1.2 葡萄糖异构酶酶活测定
• 1.2.1 酶活测定常用方法
• 1.2.2 常用方法的比较
• 1.3 葡萄糖异构酶的分离纯化
• 1.4 葡萄糖异构酶的固定化
• 1.5 未来研究发展趋势
• 1.5.1 改善热稳定性
• 1.5.2 降低最适pH
• 1.5.3 改变底物专一性
• 1.6 本课题的立题背景、意义及研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 主要原料
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 产葡萄糖异构酶菌种的筛选
• 2.2.2 放线菌的初步鉴定
• 2.2.3 菌种活化
• 2.2.4 培养方法
• 2.2.5 粗酶的制备
• 2.2.6 葡萄糖异构酶酶活力测定
• 2.2.7 链霉菌TCCC11564发酵培养基的优化
• 2.2.8 链霉菌TCCC11564发酵条件的优化
• 2.2.9 产酶曲线的测定
• 2.2.10 蛋白含量测定
• 2.2.11 发酵液中葡萄糖异构酶的提取
• 2.2.12 葡萄糖异构酶的纯化
• 2.2.13 SDS-PAGE电泳
• 2.2.14 葡萄糖异构酶分子量的测定
• 2.2.15 米氏常数的测定
• 2.2.16 葡萄糖异构化实验
• 2.2.17 葡萄糖异构酶的固定化
• 3 结果与讨论
• 3.1 高产葡萄糖异构酶菌种的筛选
• 3.1.1 高产葡萄糖异构酶菌种初筛
• 3.1.2 高产葡萄糖异构酶菌种复筛
• 3.1.3 产酶性能测定
• 3.2 放线菌S8的初步鉴定
• 3.2.1 放线菌S8菌落形态
• 3.2.2 放线菌S8菌体形态
• 3.3 链霉菌TCCC11564产酶条件优化
• 3.3.1 培养基成分的单因素优化
• 3.3.2 交实验
• 3.3.3 培养条件的优化
• 3.4 葡萄糖异构酶的提取与纯化
• 3.4.1 发酵液中葡萄糖异构酶的提取结果
• 3.4.2 葡萄糖异构酶的纯化
• 3.5 链霉菌TCCC11564酶学性质的研究
• 3.5.1 葡萄糖异构酶的最适温度及热稳定性
• 3.5.2 葡萄糖异构酶的最适pH及其pH稳定性
• 3.5.3 金属离子对链霉菌TCCC11564葡萄糖异构酶活力的影响
• 3.5.4 链霉菌TCCC11564葡萄糖异构酶葡萄糖异构化实验
• 3.6 链霉菌TCCC11564葡萄糖异构酶的固定化
• 4 结论
• 5 展望
• 6 参考文献
• 7 硕士期间论文发表情况
• 8 致谢