固定化β-葡萄糖苷酶制备及连续水解虎杖苷的研究

论文摘要

以戊二醛为交联剂、碳酸钙为致孔剂，反相悬浮交联制备出交联壳聚糖微球；用二环己基碳二亚胺（DCC）缩合交联壳聚糖微球和赖氨酸，制备出交联壳聚糖-赖氨酸树脂；以交联壳聚糖-赖氨酸树脂为载体制备固定化β-葡萄糖苷酶；制备固定化β-葡萄糖苷酶的最佳工艺条件为：交联反应时间3.0h，磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液pH7.0，β-葡萄糖苷酶：戊二醛：载体游离氨基的摩尔比为1.8×10-4﹕1﹕1。制得的固定化β-葡萄糖苷酶活力为32.24U/mg，酶蛋白偶联率为62.02%，活力回收达80.9%。以对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷为底物，测得固定化β-葡萄糖苷酶的主要酶学性质为：最适pH区间5.56.5，最适温度区间4050℃，米氏常数Km=47.69mmol/L，为游离β-葡萄糖苷酶的1.11倍；65℃半衰期为15.7h，40℃重复使用半衰期为44次，4℃贮存半衰期为295天。以固定化β-葡萄糖苷酶装配成柱式生物反应器（φ1.2×40），用于连续水解虎杖苷制备白藜芦醇，最佳工艺条件为：温度45℃，pH7.0，底物浓度为2.0%（w/v），流速为1.0mL/min。在此条件下，虎杖苷单次水解率达51.31%。连续循环水解8h，虎杖苷水解率达85.8%，固定化β-葡萄糖苷酶的剩余活力为82.17%，连续水解半衰期为24.23h。筛选出大孔吸附树脂XAD-7HP分离白藜芦醇，该树脂对白藜芦醇和虎杖苷的批式吸附容量分别为：37.63mg/g和25.47mg/g，吸附平衡时间均为2h；上柱流速为1mL/min时，XAD-7HP对白藜芦醇和虎杖苷柱式动态吸附量分别为30.04mg/g和20.36mg/g。用200mL70%乙醇为洗脱剂，洗脱流速为2mL/min对白藜芦醇柱式洗脱率达92.58%；用200mL40%乙醇为洗脱剂，以洗脱流速为2mL/min对虎杖苷柱式洗脱率达98.58%。XAD-7HP对分离水解混合液的实验结果表明，通过40%，70%乙醇依次洗脱，获得的洗脱液经高效液相色谱分析指出XAD-7HP可实现白藜芦醇和虎杖苷的有效分离，得到高纯度白藜芦醇。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 1 引言
• 1.1 壳聚糖的化学性质及其应用
• 1.2 壳聚糖及其衍生物在固定化酶中的应用
• 1.2.1 固定化酶及酶载体的简介
• 1.2.2 壳聚糖作为固定化酶载体的研究现状
• 1.2.3 β-葡萄糖苷酶的研究现状
• 1.3 白藜芦醇用途及生产现状
• 1.4 本课题的选题背景及意义
• 2 主要实验原理
• 2.1 壳聚糖的希夫碱化反应
• 2.2 氨基与羧基的缩合反应
• 2.3 制备固定化酶的反应
• 2.4 β-葡萄糖苷酶的催化机理
• 2.5 虎杖苷水解反应
• 2.6 分离纯化白藜芦醇
• 2.7 高效液相色谱检测原理
• 3 实验仪器及试剂
• 3.1 实验仪器
• 3.2 实验试剂
• 4 实验方法
• 4.1 制备固定化β-葡萄糖苷酶载体
• 4.1.1 制备交联壳聚糖树脂
• 4.1.2 制备交联壳聚糖-赖氨酸树脂
• 4.2 制备固定化β-葡萄糖苷酶
• 4.2.1 试剂配制
• 4.2.2 制备固定化酶
• 4.2.3 β-葡萄糖苷酶活力的测定
• 4.2.4 酶蛋白偶联率的测定
• 4.3 固定化β-葡萄糖苷酶连续水解虎杖苷制备白藜芦醇
• 4.4 白藜芦醇的分离纯化
• 4.4.1 选择吸附树脂
• 4.4.2 批式实验
• 4.4.3 柱式实验
• 5 实验结果与讨论
• 5.1 固定化β-葡萄糖苷酶程序比较
• 5.2 制备固定化β-葡萄糖苷酶的最适条件
• 5.2.1 交联时间
• 5.2.2 pH 值
• 5.2.3 酶与载体氨基的摩尔比
• 5.2.4 戊二醛与载体氨基的摩尔比
• 5.3 固定化β-葡萄糖苷酶的酶学性质
• 5.3.1 米氏常数 Km
• 5.3.2 最适 pH
• 5.3.3 最适反应温度
• 5.3.4 热稳定性
• 5.3.5 重复使用稳定性
• 5.3.6 贮存稳定性
• 5.4 固定化β-葡萄糖苷酶连续水解虎杖苷制备白藜芦醇
• 5.4.1 底物浓度对水解率的影响
• 5.4.2 流速对水解率的影响
• 5.4.3 连续循环水解虎杖苷
• 5.5 白藜芦醇的分离纯化
• 5.5.1 批式实验结果
• 5.5.2 柱式动态吸附
• 5.5.3 柱式动态洗脱
• 6 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• A. 作者在攻读硕士学位期间发表的论文目录
• B. 作者在攻读硕士学位期间取得的科研成果目录