论文摘要
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, S. aureus）通过产生多种毒力因子引起人和动物致病。研究表明,TRAP是调节这些毒力因子表达的重要调控蛋白,且具有良好的免疫保护作用;IsdB是构成S. aureus铁离子获取体系的重要成分,也具有良好的免疫原性。为了寻求免疫保护作用更强的候选免疫原,研制预防S. aureus感染疫苗,本实验选取isdB免疫优势区段的基因序列,与trap基因融合表达,并用表达的融合蛋白制备免疫原,研究该融合蛋白的免疫保护作用。本研究首先将isdB基因分成三段,参照GenBank上发表的S. aureus Newman株基因序列设计三对引物,分别扩增这三段基因片段,即isdB1、isdB2和isdB3,再分别克隆到pMD18-T载体上。测序后与GenBank上已发表的序列进行对比分析。然后,将isdB1、isdB2和isdB3基因片段分别插入到pET-32a载体上,构建重组质粒pET32a-isdB1、pET32a-isdB2和pET32a-isdB3。转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导后检测其表达,并以小鼠全菌体免疫血清作为一抗进行western-blot检测。以各表达产物、完整IsdB蛋白及PBS与等体积弗氏完全佐剂乳化后,以每只小鼠100μg的剂量背部皮下注射免疫小鼠,间隔3周,再以同样的蛋白与弗氏不完全佐剂乳化,以同样的剂量加强免疫,于加强免疫后15d攻毒。结果, isdB1、isdB2和isdB3基因片段序列与GenBank上S. aureus Newman株的相应核苷酸序列一致性为99 %、99 %、98 %。SDS-PAGE结果证实,重组质粒pET32a-isdB1、pET32a-isdB2和pET32a-isdB3在E. coli BL21中正确表达;Western-blot分析结果为完整的IsdB蛋白和pET32a-isdB3表达产物能与小鼠全菌体免疫血清发生特异性反应;免疫保护结果为重组IsdB3表达蛋白和完整IsdB蛋白具有相同的免疫保护率,且高于其他各组。以上结果表明,isdB3基因片段是isdB基因序列的免疫优势区。在isdB3基因片段与trap基因片段间添加连接肽,应用重叠延伸PCR方法扩增出融合基因isdB3-trap,并将其克隆到pMD18-T载体上,测序后与GenBank上已发表的序列（Accession No. AP009351和Accession No.EU754884）进行对比分析。然后,将isdB3-trap基因连接到pET-32a载体上,构建重组质粒pET32a-isdB3-trap。用IPTG诱导表达,经SDS-PAGE鉴定IsdB3-TRAP融合蛋白。然后,设IsdB3-TRAP融合蛋白免疫组、IsdB蛋白免疫组、TRAP蛋白免疫组、IsdB+TRAP蛋白免疫组和对照组共5组进行免疫保护实验。以上述同样的方法将表达蛋白乳化和免疫接种小鼠,并于加强免疫后15d分别用S.aureus Newman株、Wood46株和地方分离株HLJ/855/23-1攻毒,观察一周。初次免疫后,每周每组取3只小鼠采血,应用间接ELISA方法检测血清中IgG抗体水平及二次免疫后15d血清中IFN-γ、IL-4、IL-2细胞因子浓度。结果,IsdB3-TRAP融合蛋白在大肠杆菌中正确表达,各蛋白免疫组小鼠血清中IgG抗体水平随免疫次数增加而逐渐增长,在二次免疫后15d IsdB3-TRAP、IsdB、TRAP和IsdB+TRAP蛋白免疫组抗体水平分别达到:106666.7±36950.42、64000±0、53333.33±18475.21、和53333.33±18475.21;免疫组血清中细胞因子IFN-γ、IL-4和IL-2浓度与对照组相比,显著升高（p<0.05）;三种菌株攻毒结果,IsdB3-TRAP融合蛋白免疫组保护率均高于其他各组。表明本研究制备的IsdB3-TRAP融合蛋白免疫保护作用明显优于IsdB、TRAP和IsdB+TRAP蛋白,具有良好的应用前景。