论文摘要
研究背景蝙蝠属于哺乳动物中的翼手目（Chiroptera）,其数量在哺乳乳类中仅次于啮齿目,全世界蝙蝠大约有17科180属,约960种,其中我中有7科29属107种。翼手目分两个亚目:大蝙蝠亚目（Megachiroptera）,又称狐蝠,我国有1科5属7种;小蝙蝠亚目（Microchiroptera）,即通常所说的蝙蝠,我国有6科24属100种。大蝙蝠类分布于东半球热带和亚热带地区,体形较大,身体结构也较原始,只有狐蝠科1个科。小蝙蝠类分布于东、西半球的热带、温带地区,体型较小,包括菊头蝠科、蹄蝠科、叶口蝠科、吸血蝠科、蝙蝠科等十余科。蝙蝠对人类而言是有益的动物,部分种类与人类接触密切,是一个可以与人类和谐共处的重要物种。然而,研究发现蝙蝠是多种人类病毒性疾病病原体的储存宿主。已知有25个病毒科能够感染脊椎动物,其中有10个科和蝙蝠有关,且主要是RNA病毒。在感染脊椎动物的16个RNA病毒科中,至少有9个科可感染蝙蝠。迄今为止,已在蝙蝠体内分离到80多种病毒,其中一些是多种重大人兽其患疾病的传染源,对人类健康构成了巨大威胁。近年来,一些新病毒病的暴发、老病毒病4的重燃都与蝙蝠有关,如1994年澳大利亚爆发的亨德拉病毒（Hendra virus）病,1997年澳大利亚爆发的梅南高病毒（Menangle virus）病,1998年马来西亚爆发的尼巴病毒（Nipah virus）病,以及Tioman病毒（Tiomanvirus）病等。虫媒病毒（Arbovirus）是导致人类传染病的重要病原体,我国主要有5种虫媒病毒传染病:流行性乙型脑炎（乙型脑炎）、登革热、肾综合征出血热、新疆出血热和森林脑炎。其中,乙型脑炎与登革热经蚊子传播,这两种传染病的病原体（乙型脑炎病毒和登革病毒）都属于黄病毒科黄病毒属（Flavivirus）病毒。黄病毒属中的西尼罗病毒导致西尼罗热,也经蚊子传播。西尼罗热自1999年后,在过去没有报告过该病的西半球的许多国家发生爆发和流行,病死率较高,引起了全球的关注。我国虽然迄今尚没有报告发生过西尼罗热,但地理纬度与美洲流行区相似,加上日益全球化的问题,存在着发生该病流行的条件。国外已经有研究报道蝙蝠能携带乙型脑炎病毒和西尼罗病毒。国内学者从云南蝙蝠检测到乙型脑炎病毒血清抗体,更有人从海南登革热疫区蝙蝠中检测到登革病毒,但都因证据不足还不足以证实蝙蝠是此两种病毒的宿主。此外,在我国湖南地区也从没有检测到蝙蝠携带乙型脑炎病毒与登革病毒的报道。因此,了解不同地区蝙蝠携带人类病毒性疾病病原体的本底情况,对于深入认识有关病毒在人与动物进化中的关系,对于科学预防和应对可能爆发的人兽共患病具有重要的理论和实用意义。本研究拟以湖南省部分地区为现场,调查该地区蝙蝠是否能携带乙型脑炎病毒、登革病毒和西尼罗病毒这三种蚊媒病毒（mosquito-borne virus）。研究目的在湖南部分地区开展蝙蝠携带登革病毒、西尼罗病毒与乙型脑炎病毒的调查研究,探讨蝙蝠作为这些病毒的自然贮存宿主和相关疾病传染源的可能性。研究方法1.调查地区的选择选择条件为:①便利开展蝙蝠调查与标本采集:②既往有相关疾病流行。2.蝙蝠的收集与标本制备2.1蝙蝠收集在调查地区开展现场调查,了解是否有蝙蝠的栖息、栖息类型以及种类等情况。在不影响蝙蝠活动以及生态变化的情况下,根据蝙蝠的栖息地特点采用相应的方法捕捉少量蝙蝠进行研究。2.2标本制备:收集的蝙蝠经鉴定种类后无菌解剖取脑组织。所取得的标本放入1.5ml含RNAlater的冻存管中4℃运输。脑组织标本用0.1%DEPC水浸泡后高压消毒过的5ml研磨器加DEPC水无菌研磨至匀浆,3000r/min离心15min,上清即为检测标本,-70℃保存待检。3.病毒分离与鉴定方法3.1登革病毒①参考文献并引用已得到证实和公认的登革病毒特异性引物和探针,采用Taqman real-time RT-PCR方法对蝙蝠脑组织进行分子生物学检测。②将Taqman real-time RT-PCR判定为登革病毒阳性或可疑为阳性的脑组织上清液接种C6/36细胞,逐日观察细胞病变并盲传3代,分离病诲。③取细胞液或脑组织上清液脑腔接种1～3d龄的BALB/c乳鼠,观察乳鼠发病情况,有可疑发病者,取脑组织继续盲传3代,如出现规律发病者再进行Taqman real-time RT-PCR鉴定。3.2西尼罗病毒①参考文献并引用已得到证实和公认的西尼罗病毒特异性引物和探针,采用Taqman real-time RT-PCR方法对蝙蝠脑组织进行分子生物学检测。②将Taqman real-time RT-PCR判定为西尼罗病毒阳性或可疑为阳性的脑组织上清液接种BHK-21细胞,逐日观察细胞病变并盲传3代,分离病毒。③取细胞液或脑组织上清液脑腔接种1～3d龄的BALB/c乳鼠,观察乳鼠发病情况,有可疑发病者,取脑组织继续盲传3代,如出现规律发病者再进行Taqman real-time RT-PCR鉴定。3.3乙型脑炎病毒①参考文献,下载已知乙型脑炎病毒序列进行多序列比对,针对乙型脑炎病毒E基因设计特异性引物,采用普通RT-PCR方法对蝙蝠脑组织进行分子生物学检测。②将RT-PCR判定为乙型脑炎病毒阳性或可疑为阳性的脑组织上清液脑腔接种1～3d龄的BALB/c乳鼠,观察乳鼠发病情况,有可疑发病者,取脑组织继续盲传3代,如出现规律发病者再进行RT-PCR鉴定。③对PCR产物进行切胶、称重,经凝胶回收试剂盒纯化回收后,与pGEM-T载体连接,转化至感受态大肠杆菌DH5α,涂布LB平板,再接种至含AMP 5mlLB培养基中培养,取菌液进行基因序列测定,以判断DNA序列。④将测序结果利用ncbi上的BLAST软件进行在线同源性分析,并从GeneBank中下载其他乙型脑炎病毒序列,利用Clustal W进行多序列比对分析。4.质量控制①枪头、EP管等实验耗材均为一次性用品。逆转录过程采用DEPC处理所有容器和配制试剂,以去除RNA酶污染。②戴口罩、手套、帽子,在无菌间超净台上进行操作,防止试剂和实验过程受到污染。③Taqman real-time RT-PCR、RT-PCR、动物实验和细胞实验过程中均设立阳性对照、阴性对照和空白对照。研究结果1.蝙蝠基本情况从2007年4月至2007年9月期间共2次到湖南部分地区收集蝙蝠。收集了2个科8个种共344只蝙蝠。其中:2个科分别为菊头蝠科（Rhinolophidae）和蝙蛳科（Vespertilionidae）;8个种分别为:中菊头蝠（Rhinolophus affinis）156只、大耳菊头蝠（Rhinolophus macrotis）2只、中华菊头蝠（Rhinolophus sinicus）20只、大足鼠耳蝠（Myotis ricketti）1只、皮氏菊头蝠（Rhinolophus pearsoni）2只、小菊头蝠（Rhinolophus blythi）2只、普通长翼蝠（Miniopterus schreibersi）152只、马铁菊头蝠（Rhinolophus ferrumequinum）9只。此研究所收集344只蝙蝠经专家鉴定均为食虫蝙蝠,栖息地主要是房屋的缝隙、屋檐下、被废弃的房屋罩及旅游景点的山洞等,与人类接触较密切。2.蝙蝠携带登革病毒的情况①从收集到的344只蝙蝠身上获取了344份脑组织,采用Taqman Real-timeRT-PCR方法检测出4份登革病毒阳性标本,蝙蝠登革病毒的携带率为1.16%。Ct值分别为:28.62、31.36、34.46、34.78;阳性对照Ct值为24.80。阳性样品中:中华菊头蝠1例（携带率为5%）,中菊头蝠3例（携带率为1.92%）,其他蝙蝠未查出阳性结果。②将上述4份脑组织上清液接种C6/36细胞,逐日观察细胞病变,未见细胞病变,盲传3代,仍未能观察到细胞病变。③将4份脑组织上清液接种乳鼠,3d后出现轻微发病症状,由于发现不及时,乳鼠发病后过夜全被母鼠吞食掉,再融解上清液继续接种,未发现发病老鼠。3.蝙蝠携带西尼罗病毒的情况①本次实验利用Taqman Real-time RT-PCR未从344份蝙蝠脑组织标本中检测出西尼罗病毒阳性标本。②将上清液分别接种于1～3d龄的BALB/c乳鼠和BHK-21细胞,均未能分离到西尼罗病毒。4.蝙蝠携带乙型脑炎病毒的情况①采用RT-PCR方法从344只蝙蝠脑组织标本中检测出7份乙型脑炎病毒阳性标本,蝙蝠乙型脑炎病毒的携带率为2.04%。其中中菊头蝠2只,携带率为1.28%;普通长翼蝠5只,携带率为3.29%,其他种类蝙蝠未检测出乙型脑炎病毒。②将RT-PCR检测出的7份阳性样品的上清液接种于1～3d龄的BALB/c乳鼠,3d后开始发病,乳鼠发病症状为:拒乳、抽搐、侧卧、弓背,8d后全部发病死亡,成功地分离到乙型脑炎病毒。③将PCR产物纯化、测序,所得序列与GeneBank上公布的乙型脑炎序列进行同源性比较,发现所得序列与已知的乙型脑炎序列同源性为99%-100%。结论1.本研究从所收集344份蝙蝠的脑组织中未能检测到西尼罗病毒,提示该地区蝙蝠携带西尼罗病毒的几率不大。但是鉴于本研究的标本量尚不大,且有研究报道蝙蝠和西尼罗病毒存在一定的关系,故还不能肯定地排除该地区蝙蝠携带西尼罗病毒可能性。2.利用Taqman real-time RT-PCR方法从344份蝙蝠脑组织检测出登革病毒阳性样品4份（携带率为1.16%）;将这4份标本上清液接种乳鼠后发病,由于发现不及时,乳鼠发病后过夜全被母鼠吞食掉,再接种则未成功:将上清液接种细胞也未能成功地分离出登革病毒。虽然由于实验原因未能分离到登革病毒,但我们也可初步判断出这几份阳性样品中存在登革病毒。3.利用RT-PCR方法从344份蝙蝠脑组织检测出乙脑病毒阳性样品7份（携带率为2.04%）;将这7份标本接种乳鼠后均能引起发病甚至死亡;另外序列比对发现纯化所得序列与已知的乙型脑炎序列同源性为99%～100%。证实了国内的蝙蝠能携带乙型脑炎病毒。
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