人甲状旁腺激素在大肠杆菌中的表达

论文摘要

甲状旁腺激素（PTH）是由甲状旁腺分泌的一种重要的肽类调节激素,在机体的钙磷代谢,骨的形成、分化和发育等相关的诸多环节中起着关键性作用。甲状旁腺激素分子中含有84个氨基酸。 近年的研究表明,间歇地小剂量给予PTH可促进骨的合成代谢,因此在治疗骨质疏松方面被认为是最具前景的药物。研究表明PTH（1-34）具有与PTH（1-84）相同的生物功能。据此本研究利用基因工程生产用于治疗骨质疏松症的重组的人甲状旁腺激素（1-34）。 利用基因重组技术将人PTH（1-34）基因克隆到表达载体pThioHisA中。重组的表达载体转化到E.coli BL21（DE3）和DH5α中,经异丙醇-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG）诱导表达。得到融合表达蛋白。经条件优化后,Western-blot分析证实得到了重组人甲状旁腺激素rhPTH（1-34）。经硫酸铵沉淀法纯化后将目的蛋白作用于3T3细胞,结果显示该蛋白可以刺激细胞内cAMP的产生,表明重组的目的蛋白具有一定的生物活性。 从以上结果我们可以得出结论:本实验已经利用基因工程技术得到了具有生物活性的重组的人甲状旁腺激素,而且筛选出了一株高效表达菌株。 我们证实大肠杆菌BL21（DE3）菌株为理想的表达菌株,从中筛选出的最佳表达条件为:IPTG终浓度为0.5mM,诱导时间为4h。

论文目录

• 第一章 生物技术概况
• 1.1 生物技术及其发展现状
• 1.2 现代生物技术--基因工程发展概况
• 1.3 生物技术制药及其发展现状
• 1.3.1 生物药物的分类
• 1.3.2 生物技术制药现状
• 1.3.2.1 欧洲国家生物技术制药发展现状
• 1.3.2.2 美国生物制药现状
• 1.3.2.3 中国生物制药现状
• 1.4 生物制药展望
• 第二章 骨质疏松症与甲状旁腺激素
• 2.1 骨质疏松症现状
• 2.1.1 骨质疏松症及其分类
• 2.1.2 骨质疏松症的危害
• 2.1.3 骨质疏松症治疗药物
• 2.2 甲状旁腺激素
• 2.2.1 PTH基因及其结构
• 2.2.2 PTH基因的表达与调控
• 2.2.3 PTH受体及相关肽
• 2.2.4 PTH的生理功能
• 2.2.5 PTH生理功能的研究进展
• 2.2.6 PTH的临床应用展望
• 第三章 本论文研究的主要内容及其意义
• 3.1 本论文研究的意义
• 3.2 本论文研究的主要内容
• 第四章 实验材料和方法
• 4.1 实验原理
• 4.1.1 原核表达
• 4.1.2 表达载体的选择
• 4.2 材料
• 4.3 方法
• 4.3.1 基因克隆
• 4.3.2 双酶切
• 4.3.3 连接
• 4.3.4 大肠杆菌DH5α，BL21（DE3）感受态细胞的制备与转化
• 4.3.5 挑选阳性克隆
• 4.3.6 pThioHisA-PTH在大肠杆菌中的表达
• 4.3.7 目的蛋白（rhPTH）体外活性的检测
• 第五章 结果
• 5.1 目的基因PTH（1-34）的克隆
• 5.2 pThioHisA-rhPTH表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达
• 5.2.1 表达载体的构建
• 5.2.2 表达菌液破碎检测
• 5.3 表达产物的Western-blot分析结果
• 5.4 优化表达条件
• 5.4.1 筛选表达菌株
• 5.4.2 筛选诱导时间
• 5.4.3 IPTG终浓度筛选
• 5.5 重组目的蛋白生物活性的体外检测
• 第六章 讨论
• 6.1 原核表达的经验
• 6.2 大肠杆菌中表达异源基因的现状
• 6.3 PTH合成途径及其特点
• 6.4 本实验结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录A 溶液的配制方法
• 附录B （攻读硕士学位期间发表论文目录）