PhaB法检测MTB利福平耐药性及其耐药基因突变

论文摘要

结核病（Tuberculosis,TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）引起的一种慢性传染性疾病,是目前世界上最普遍和最严重的人类传染病之一,也是全世界由单一致病菌致死最多的疾病之一。据世界卫生组织报告显示,约三分之一的人口感染了结核分枝杆菌,估计每年有800～1 000万新发病例。从1953年～1985年,我国结核病发病率呈下降趋势,但上世纪90年代,由于耐药性结核分枝杆菌的出现与传播、艾滋病的流行以及人口的频繁流动等原因,结核病疫情呈现出全球性的回升。在抗结核病治疗药物中,RFP是治疗结核病最有效的一线药物之一,但其耐药率也非常高。有报告称,约90%的结核分枝杆菌耐RFP菌株同时也对INH耐药,因而,单独进行RFP敏感性分析也可以作为耐多药结核分枝杆菌的筛选指标。有关RFP的耐药机制及其耐药性的快速检测也是近年来结核病防治工作中的研究热点。【目的】本研究旨在使用结核分枝杆菌RFP耐药性的噬菌体生物扩增法（Phage Amplified Biologically Assay,PhaB）快速检测方法,探讨和评价此方法在实际检测临床标本应用中的价值;同时对结核分枝杆菌RFP耐药菌株的RFP耐药相关基因rpoB的突变进行研究,对RFP耐药机制进行初步探索,为以后进行RFP耐药机制研究提供相关实验基础。【方法】实验第一部分,用抗酸染色法和酸性L-J培养基培养法检测临床痰标本中的结核分枝杆菌,并对分离出来的菌株做菌型鉴定,获得结核分枝杆菌临床分离株。实验第二部分,以绝对浓度法对结核分枝杆菌临床分离株进行RFP耐药性检测,筛选出对RFP耐药的临床分离株。实验第三部分,应用PhaB法,对108例结核分枝杆菌临床分离株进行RFP耐药性的测定,并将检测结果与常规绝对浓度法结果进行比较,探讨和评价PhaB法的应用价值。实验第四部分,将结核分枝杆菌RFP耐药相关基因rpoB进行PCR扩增后对全基因进行测序,对rpoB基因突变进行研究。【结果】对108株结核分枝杆菌临床分离株进行RFP耐药性测定,常规绝对浓度药敏法检测结果为敏感26株,耐药82株;PhaB法检测结果为敏感24株,耐药84株,与绝对浓度法检测结果符合率为92.59%。如果以绝对浓度法检测RFP耐药性结果为评判标准,则PhaB法测定RFP耐药性的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和准确性分别为96.34%、77.78%、94.05%、87.50%和92.59%。且在实际操作过程中,PhaB法检测RFP耐药性仅需要2～3天,与常规绝对浓度药敏法符合率高且实验结果重复性好,操作者的安全也有保障。对43株RFP耐药株进行rpoB基因测序,结果42株的rpoB基因存在各种不同形式的突变,突变率达到97.61%。在所有突变形式中,除已经见报道的突变形式外,还发现了1个新的突变位点,新突变的形成原因还有待进一步的研究。【结论】PhaB法检测结核分枝杆菌RFP耐药性具有快速、操作简便、安全性高、与常规药敏方法符合率较高等特点。且不需要特殊仪器设备,实验成本低廉,可以作为RFP耐药性快速检测的筛选方法。在我国这样的结核病耐药率较高的发展中国家和其它经济落后的贫困国家和地区,更适宜推广使用。本研究也证明,RFP耐药相关基因rpoB的突变是结核分枝杆菌对RFP产生耐药的主要原因,更重要的是在对rpoB基因序列检测过程中,我们发现了1种新的突变位点,且此突变位点是在突变核心区域之外,该结果为进一步从分子水平研究RFP耐药的理论研究以及研制RFP耐药检测基因芯片具有重要的参考价值。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 综述
• 1.1 一线抗结核分枝杆菌药物耐药的分子机制
• 1.1.1 异烟肼耐药的分子机制
• 1.1.2 利福平耐药的分子机制
• 1.1.3 吡嗪酰胺耐药的分子机制
• 1.1.4 乙胺丁醇耐药的分子机制
• 1.1.5 链霉素耐药的分子机制
• 1.2 二线抗结核分枝杆菌药物耐药的分子机制
• 1.2.1 氟喹诺酮类（FQNS）耐药的分子机制
• 1.2.2 乙硫异烟胺（ETA）耐药的分子机制
• 1.2.3 大环内酯类（MIs）耐药的分子机制
• 1.2.4 对氨基水杨酸（PAS）耐药的分子机制
• 1.2.5 环丝氨酸耐药的分子机制
• 1.3 结核分枝杆菌耐药性检测方法研究进展
• 1.3.1 表型检测
• 1.3.2 基因检测
• 2 结核分枝杆菌的酸性L-J培养基培养法测定及菌型鉴定
• 2.1 前言
• 2.2 材料
• 2.2.1 研究对象
• 2.2.2 研究材料
• 2.3 实验方法及实验步骤
• 2.3.1 痰标本的镜检
• 2.3.2 分枝杆菌的分离培养
• 2.3.3 统计学方法
• 2.4 实验结果
• 3 改良L-J培养基培养法测定结核分枝杆菌RFP耐药性
• 3.1 前言
• 3.2 材料
• 3.2.1 研究对象
• 3.2.2 研究材料
• 3.3 实验方法及实验步骤
• 3.3.1 绝对浓度法培养基的配制
• 3.3.2 含药培养基的配制
• 3.3.3 菌悬液制备
• 3.3.4 接种方法
• 3.3.5 结果报告
• 3.3.6 质量控制
• 3.4 实验结果
• 3.5 讨论
• 4 PhaB法测定结核分枝杆菌及临床分离株RFP耐药性
• 4.1 前言
• 4.2 材料
• 4.2.1 研究对象
• 4.2.2 研究材料
• 4.3 实验方法及实验步骤
• 4.3.1 PhaB法检测痰标本中结核分枝杆菌
• 4.3.2 PhaB法检测临床痰标本中结核分枝杆菌RFP耐药性
• 4.3.3 PhaB法检测结核分枝杆菌临床分离株RFP耐药性
• 4.3.4 统计学方法
• 4.4 实验结果
• 4.4.1 PhaB法与涂片抗酸染色法结果比较
• 4.4.2 PhaB法与培养法结果比较
• 4.4.3 PhaB法与绝对浓度法检测RFP耐药性结果比较
• 4.5 讨论
• 5 结核分枝杆菌临床分离RFP耐药株rpoB基因突变研究
• 5.1 前言
• 5.2 材料
• 5.2.1 研究对象
• 5.2.2 研究材料
• 5.3 研究方法及实验步骤
• 5.3.1 标准菌种的培养及保存
• 5.3.2 药物敏感实验
• 5.3.3 PCR扩增
• 5.3.4 琼脂糖凝胶电泳
• 5.3.5 PCR扩增产物的DNA序列测定
• 5.3.6 统计学方法
• 5.4 实验结果
• 5.4.1 rpoB基因PCR扩增的结果
• 5.4.2 rpoB基因突变自动测序的结果
• 5.5 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录A NCBI提供的结核分枝杆菌rpoB基因序列
• 附录B 英文缩写注释
• 致谢
• 作者简介及读研期间主要科研成果