论文摘要
背景:温病湿热证是临床常见病证,多数研究者依据“湿热之邪始虽外受,终归脾胃”的理论,将中焦湿热证或脾胃湿热证作为其典型阶段。温病湿热证的致病机制涉及血浆内毒素、血脂水平、水液代谢、炎症细胞因子、免疫功能、胃肠激素等多个方面,并不局限于某一脏腑或某一靶点。岭南地区,雨水充沛,气候炎热,湿热类温病多发,蒿芩清胆汤、黄连解毒汤、三仁汤等清热祛湿类方药临床运用广泛,因此,在岭南地区研究温病湿热证有重要意义。以“肥甘饮食+湿热外环境+生物致病因子”的温病湿热证模型基本为研究者所接受,生物致病因子集中在大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和内毒素,而将病毒纳入复合因素进行造模还未见报道。不同的生物因子可以导致不同的湿热类温病,对于更多生物致病因子的探讨,有助于丰富温病湿热证的内涵。目的:本研究拟以MHV-A59和大肠杆菌作为生物致病因子,建立两种小鼠温病湿热证动物模型,从NF-κB、AOP4、Th1/Th2、CD4+/CD8+方面探讨温病湿热证的部分致病机制。以MHV-A59温病湿热证模型为切入点,探讨湿热因素（肥甘饮食+湿热外环境）、病毒因素在上述机制形成中的地位。运用清热祛湿类方药（蒿芩清胆汤、黄连解毒汤、三仁汤）对MHV-A59温病湿热证的治疗作用来反证其致病机制,并初步探讨清热祛湿法的作用机理。外感湿热证是临床常见的湿热类温病,探讨外感湿热证患者外周血T细胞免疫水平的变化是对实验研究的补充与佐证。方法:1、文献研究,采用评述的方法,整理温病湿热证动物模型的研究现状,分析其致病机制研究的不足,归纳清热祛湿法和MHV的研究进展,以期理清本实验的研究思路。2、实验研究,本实验所选用的均为4周龄左右的雄性BALB/c小鼠。①温病湿热证模型的建立:动物随机分为3组:正常组、模型组（肥甘饮食+湿热外环境+MHV-A59造模）、肠菌组（肥甘饮食+湿热外环境+大肠杆菌造模）,检测小鼠血清TG、TNF-α水平及肝组织病理切片,观察动物症状及体征。②在模型成功的基础上探讨温病湿热证的致病机制:动物随机分为3组:正常组、模型组、肠菌组,ELISA法检测小鼠血清IL-4、IFN-γ水平,免疫组化法检测小鼠肝脏NF-κB与胃粘膜AQP4表达,FCM检测小鼠外周血CD4+/CD8+比例。③造模因素在MHV-A59温病湿热证致病机制形成中的地位:动物随机分为4组:正常组、模型组、湿热组（肥甘饮食+湿热外环境造模）、病毒组（单纯MHV-A59造模）,采用FQ-PCR法检测小鼠肝脏MHV-A59含量,ELISA法检测小鼠IL-4、IFN-γ水平,免疫组化法检测小鼠肝脏NF-κB与胃粘膜AQP4表达,FCM检测小鼠外周血CD4+/CD8比例。④清热祛湿类方药的对温病湿热证机制的反证:动物随机分为5组:正常组、模型组、A药组（模型组用蒿芩清胆汤治疗）,B药组（模型组用黄连解毒汤治疗）、C药组（模型组用三仁汤治疗）;采用FQ-PCR法检测小鼠肝脏MHV-A59含量,ELISA法检测小鼠血清IL-4、IFN-γ水平,免疫组化法检测小鼠肝脏NF-κB与胃粘膜AQP4表达,FCM检测小鼠外周血CD4+/CD8+比例。3、临床研究,病例来源于广州中医药大学第一附属医院外感发热门诊,共30例,辨证属外感湿热证者。对照组15人,为同时期健康志愿者。ELLSA法检测患者与健康者血清IL-4、IFN-γ水平,运用蒿芩清胆汤治疗3日,复测上述指标,观察蒿芩清胆汤的干预作用。结果:1、文献:就目前温病湿热证动物模型的研究现状而言,尚未将病毒作为生物致病因子复制模型;对温病湿热证致病机制未从多模型、多层次进行探讨。清热祛湿类方药对温病湿热证的治疗作用是反证其致病机制的手段之一。MHV-A59是研究人类冠状病毒的替代品之一,可将其作为生物致病因子来复制温病湿热证动物模型。2、实验:①与正常组比较,两种温病湿热证模型组小鼠血清TG及TNF-α水平明显升高（P＜0.01）,两组造模动物均不现程度出现了发热、疲倦、纳呆、腹泻、体重减少、毛发无泽等症状,提示造模成功。②模型组、肠菌组肝脏NF-κB表达、胃粘膜AQP4表达及外周血Th1/Th2（IFN-γ/IL-4）比值较正常组明显升高（P＜0.05或P＜0.01）;模型组的CD4+/CD8+比例较正常组明显升高（P＜0.01）,此类结果提示上述靶点的变化可能是温病湿热证的致病机制之一。③模型组小鼠肝脏病毒含量较病毒组有下降趋势,但无统计学意义（P＞0.05）。病毒组、模型组肝脏NF-κB表达较正常组明显升高（P＜0.01）,湿热组较正常组升高不明显（P＞0.05）,病毒组与模型组无明显差异（P＞0.05）。湿热组、模型组胃粘膜AQP4表达较正常组明显升高（P＜0.05）,病毒组较正常组升高不明显（P＞0.05）,湿热组与模型组无明显差异（P＞0.05）。病毒因素主要影响到IFN-γ水平致使模型组Th1/Th2比值较正常组明显升高（P＜0.05）;病毒因素主要影响到CD8+百分比致使模型组的CD4+/CD8+比值较正常组明显升高（P＜0.05）;此类结果提示病毒因素是导致NF-κB表达升高、T细胞免疫失调的主要原因,而饮食与环境因素是导致AQP4表达升高的主要原因。④与模型组比较,A药组肝脏病毒含量有降低趋势,但无统计学意义（P＞0.05）,B药组肝脏NF-κB表达明显降低（P＜0.05）,C药组胃粘膜AQP4表达有降低趋势,但无统计学意义（P＞0.05）,A药组Th1/Th2比值明显趋于平衡（P＜0.05）,A药组CD4+/CD8+比值升高,但无统计学意义（P＞0.05）。这些药物的作用反证了本研究涉及的温病湿热证致病机制。3、临床:与正常组比较,外感湿热证患者血清IL-4水平变化不明显（P＞0.05）,血清IFN-γ水平显著升高（P＜0.01）,Th1/Th2比值失衡明显（P＜0.01）;与治疗前比较,蒿芩清胆汤明显降低IFN-γ水平而使Th1/Th2归于平衡（P＜0.01）。本研究结果提示Th1/Th2比值失衡可能是外感湿热证发病机制之一。结论:经文献整理,“肥甘饮食+湿热外环境+生物致病因子”是复制温病湿热证模型较为理想的路线,生物致病因子主导着模型“病”的特性,饮食和环境因素主导着模型“证”特性。本研究的结论如下:1、以MHV-A59作为生物致病因子,结合肥甘饮食及湿热外环境因素构建的动物模型,可以作为温病湿热证动物模型之一,也是一种新的病证结合模型;2、肝脏NF-κB表达增强、胃粘膜AQP4表达增强及血清Th1/Th2细胞因子失衡是两种温病湿热证共同的致病机制之一;外周血CD4+/CD8+比例失调是MHV-A59温病湿热证的致病机制之一;3、在MHV-A59温病湿热证形成中,MHV-A59因素主导着炎症反应与T细胞免疫紊乱,肥甘饮食和湿热外环境主导着水液代谢失常;4、清热祛湿类方药具有不同程度降低肝脏NF-κB和胃粘模AQP4表达、改善Th1/Th2失衡及CD4+/CD8+比例失调、降低肝脏MHV-A59病毒含量的作用,反证了温病湿热证的上述致病机制;5、临床研究显示Th1/Th2细胞因子比例失衡是外感湿热证发病机理之一,调整Th1/Th2失衡是蒿芩清胆汤治疗外感湿热证的机制之一。
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