小麦渐渗系新品种山融3号耐盐表达谱和耐盐相关基因研究

论文摘要

植物的耐盐性是由多基因控制的复杂的数量性状,盐胁迫应答相关的基因涉及到代谢、细胞防御、能量、离子平衡和转运、细胞生长和分裂等诸多方面,所有这些基因构成一个复杂的调控网络。因此,对盐渍胁迫下植物基因表达整体概况的研究有助于我们更好的理解植物的耐盐机制。耐盐小麦品种山融3号是小麦品种济南177（Triticum aestivum L.2n=42）与其小麦族偃麦草属禾草长穗偃麦草（Thinopyrum ponticum 2n=70）经过不对称体细胞杂交技术获得的体细胞杂种渐渗系。遗传及生理生化的分析表明,该品种含有长穗偃麦草染色体小片段,耐盐指数及各项生理生化指标均其耐盐性明显优于亲本小麦。山融3号不同于其它耐盐相关研究所利用的单一遗传背景的材料,其耐盐性由主效基因和微效基因共同控制。本文利用小麦全基因组芯片,研究了山融3号及其亲本济南177经不同时间盐胁迫后不同组织的诱导表达谱,从转录组的水平对小麦盐胁迫诱导基因表达情况进行分析,并从山融3中克隆了3个耐盐相关基因,进行了功能研究,主要研究内容和结果包括:1.利用Affymetrix小麦基因芯片分析小麦盐胁迫诱导的基因表达谱采用Affymetrix小麦全基因组芯片（GeneChip Wheat Genome Array）,首次构建了小麦体细胞杂交耐盐品种山融3号及其亲本济南177盐胁迫诱导的表达谱,一共获得6504个差异表达探针,代表了5,577个盐胁迫诱导的差异表达基因。主要参与主要包括胁迫响应、钙离子结合、转录调控、氮代谢、氨基酸代谢以及氧化还原等过程。在盐胁迫下根系中的差异表达基因比叶片中的大约多一倍,由于根系直接面对盐胁迫,所以其差异表达基因多与离子吸收有关,主要包括许多水通道蛋白、钙依赖的钾离子通道以及一些非选择性通道蛋白等。对盐胁迫特异性诱导或者抑制表达探针的分析表明液泡膜钠氢逆向转运蛋白基因Na+/H+ antiporter（NHX1）、液泡膜焦磷酸酶基因PPase和TaHKT1在山融3号和济南177中差异表达,揭示离子吸收和区隔化的调控可能在山融3号的耐盐中起了重要作用。部分重要盐胁迫响应相关基因在山融3号和济南177之间也存在差异表达,ABA合成途径相关基因以及ABA响应的因子,JA以及GA信号途径的有关基因在盐胁迫后均上调表达,表明在小麦中激素途径与逆境响应途径也有交叉。组蛋白可以通过转录后修饰来诱导或者抑制许多功能基因的表达,它们在盐胁迫后的大量下调表达暗示其在山融3号的盐胁迫应答中起作用,值得我们进一步研究。2.小麦耐盐相关基因TaCHP的全长cDNA克隆及初步的功能分析对一个功能未知的锌指蛋白基因TaCHP进行了克隆和测序,表达谱分析发现盐胁迫后TaCHP在根系中特异性表达,而且在山融3号和济南177间有明显的差异表达。TaCHP表达不受干旱胁迫、氧化胁迫的影响,而ABA胁迫后其表达谱与盐胁迫的表达一致,推测TaCHP基因在山融3号的表达与渗透胁迫和氧化胁迫无关,可能是盐胁迫和ABA响应途径共同的调控因子。组织原位杂交结果表明TaCHP在山融3号根系成熟区的皮层细胞和导管细胞中都有表达,说明TaCHP基因参与了山融3号的盐胁迫过程。TaCHP的蛋白结构分析发现TaCHP的氨基酸序列包含三个植物特有的锌指蛋白结构域—DC1 domain,推测其可能参与了植物磷酸肌醇参与逆境胁迫的响应途径。拟南芥中过量表达TaCHP基因后,转基因植株的抗盐性生长明显好于对照,说明外源基因的插入和过量表达可能提高了转基因株系对于Na+的耐受性。3.小麦中耐盐相关的蛋白酶抑制剂基因TaWRSI5的分析从山融3号和其亲本中克隆了TaWSRI5基因。该基因在DDRT和基因芯片检测中都受到盐胁迫诱导表达。TaWSRI5编码一个小麦中的BBI型蛋白酶抑制剂（Bowman-Birktype Protease Inhibitor）,具有胰蛋白酶抑制活性。表达谱分析表明TaWRSI5基因在H2O2胁迫后1小时即被强烈诱导表达,而在盐处理后大约6小时,铝胁迫和干旱胁迫后大约24小时,TaWRSI5基因的表达才到达峰值,所以推测TaWRSI5基因的表达受到H2O2的调控,可能参与了多种胁迫响应途径。TaWRSI5的组织原位杂交发现其在山融3号根尖成熟区的内皮层细胞中特异表达,而在济南177的相同位置上没有检测到明显的杂交信号,过表达TaWRSI5基因的拟南芥株系也可以在一定程度上提高转基因株系的耐盐性。揭示TaWRSI5基因可能通过参与调控Na+的运输或者调节Na+在植物体内的分布来提高植物的耐盐性。小麦耐盐相关基因TaSKC1的克隆及初步功能分析小麦耐盐的一个重要机制是调节离子的吸收,运输从而维持植物体内较低的Na+浓度。利用RACE技术分别从山融3号,济南177中克隆了小麦中的同源基因TaSKC1,系统进化分析表明TaSKC1的氨基酸序列与OsSKC1和AtHKT1的同源性最高,推测其可能参与Na+通过韧皮部汁液从地上部分至根部的再循环过程,从而减少叶片中Na+的积累。酵母突变体功能互补试验揭示TaSKC1能够介导盐胁迫后Na+的吸收,过表达TaSKC1的酵母细胞对Na+更敏感。推测盐胁迫后TaSKC1的表达量降低可能是离子胁迫反馈调节的结果,盐胁迫下植物中由于积累过多的Na+,使细胞受到盐害,激活大量盐胁迫响应因子,通过逆境胁迫的信号转导系统,反馈抑制TaSKC1的表达,从而降低Na+进入植物体或者向地上部位运输的速率,维持植物细胞内的离子平衡。4.小麦体细胞杂交与基因突变和基因表达差异TaSKC1和TaCHP基因的序列比较分析表明其是来自其小麦亲本济南177,而且在进化过程中非常保守,所以他们在盐胁迫下山融3号和济南177间的差异表达很可能取决于上游调控序列的不同。对TaWSRI5基因序列的分析显示:山融3号中TaWSRI5基因可能来自长穗偃麦草与济南177中的同源基因重组,另外有少数碱基发生了点突变。研究结果从分子水平上验证了体细胞杂交可以导致受体的基因组的剧烈变化,不仅可引起受体功能基因的结构变化,而且还导致其表达水平的变化,这种的变化可促进新基因、新性状的形成和小麦种质创新。总之,在转录水平上对山融3号和济南177的研究发现体细胞杂交导致了二者基因组中大量基因的差异表达,其中山融3号中特异诱导或者抑制表达的基因可能是影响其耐盐性的重要相关基因。对山融3号中的TaCHP、TaWRSI5和TaSKC1基因的研究表明,它们可能是山融3号复杂的耐盐调控网络的重要组分。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.植物耐盐研究现状
• 1.1 盐胁迫对植物的影响
• 1.2 植物对盐胁迫的适应机理
• 2.基因芯片技术及其在植物耐逆研究方面的应用
• 2.1 基因芯片种类
• 2.2 基因芯片技术:芯片制备、样品制备、杂交反应和信号检测和结果分析
• 2.3 基因芯片技术在植物耐盐研究中的应用
• 3.立题依据与研究内容
• 3.1 本论文立题依据
• 3.2 研究内容
• 第二章 利用Affymetrix小麦基因芯片分析小麦盐胁迫诱导的基因表达谱
• 1.实验材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 材料种植
• 1.3 取样方法
• 2.实验方法
• 2.1 RNA提取和纯化
• 2.2 cDNA的合成和纯化
• 2.3 cRNA的合成和纯化
• 2.4 cRNA的片段化及杂交液的配制
• 2.5 芯片杂交、洗脱、染色及扫描
• 2.6 芯片杂交的数据分析
• 3.结果与讨论
• 3.1 盐处理下的表型差异
• 3.2 芯片质量监控和杂交结果初步分析
• 3.3 山融3号和济南177差异表达探针的分析
• 3.4 差异表达探针的功能注释以及分类
• 3.5 部分探针的染色体定位
• 4.小结
• 第三章 小麦耐盐体细胞杂种渐渗系山融3号耐盐相关基因研究
• 一 材料和方法
• 1.植物材料
• 2.实验方法
• 2.1 植物总RNA的提取
• 2.2 逆转录合成cDNA
• 2.3 差异cDNA片段的克隆和序列测定
• 2.4 末端快速扩增（RACE）和全长cDNA的获得
• 2.5 开放阅读框的克隆和序列测定
• 2.6 基因组序列的扩增
• 2.7 基因表达分析（RT-PCR和real-time2PCR）
• 2.8 原核表达分析
• 2.9 组织原位杂交
• 2.10 酵母功能互补试验
• 2.11 植物表达载体构建（Ubi/35S启动子）
• 2.12 农杆菌感受态的制备与转化
• 2.13 转基因功能验证—拟南芥转化及筛选
• 2.14 生长点转化小麦山融3号及转基因植株分析
• 二 结果与分析
• （一）小麦耐盐相关基因TaCHP的全长cDNA克隆及初步的功能分析
• 1.1 基因芯片中TaCHP信息的分析和表达验证
• 1.2 小麦TaCHP基因的cDNA克隆与序列分析
• 1.3 TaCHP基因表达分析
• 1.4 原核表达
• 1.5 植物表达载体构建
• 1.6 拟南芥转化及表型分析
• 1.7 小麦的遗传转化和转基因株系的初步鉴定
• 1.8 讨论
• （二）小麦中耐盐相关的蛋白酶抑制剂基因TaWRSI5的表达分析
• 2.1 基因芯片中TaWRSI5探针杂交信息的分析
• 2.2 TaWSRI5基因的cDNA克隆与序列分析
• 2.3 小麦中WRSI5基因的表达分析
• 2.4 TaWRSI5的体外蛋白酶抑制活性检测
• 2.5 TaWRSI5转基因拟南芥株系的表型分析
• 2.6 讨论
• （三）小麦耐盐相关基因TaSKC1的克隆及初步功能分析
• 3.1 小麦TaSKC1基因的cDNA全长克隆及序列分析
• 3.2 TaSKC1基因表达分析
• 3.3 酵母突变菌株的互补试验
• 3.4 植物表达载体pUN330/TaSKC1的构建及小麦转化
• 3.5 讨论
• 总结
• 附表
• 参考文献
• 博士研究生在读期间发表论文情况
• 博士研究生在读期间荣获奖励情况
• 研究生在读期间参与科研项目情况
• 致谢
• 发表论文
• 学位论文评阅及答辩情况表