论文摘要
研究目的:既往认为有四条代谢通路参与糖尿病慢性并发症的发生和发展,包括多元醇通路的活性增加,晚期糖化终末产物（AGEs）的形成,蛋白激酶C（PKC）的激活,已糖胺代谢途径的增强,目前认为其共同的机制是氧化应激。高糖刺激氧自由基（ROS）生成,氧化应激反应增强,激活四条代谢通路,反过来又导致ROS增加,形成恶性循环,损伤靶器官。同时,糖尿病作为应激原,若高血糖长期得不到控制,下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴处于过度激活状态,内环境稳态受到破坏,进一步加重高糖损伤。褪黑素（Mel）作为松果体分泌的神经内分泌激素,是公认的强抗氧化剂之一,具有清除氧自由基、提高抗氧化酶活性等作用;近年来的研究还发现褪黑素可以调节HPA轴活性。鉴于褪黑素对神经、内分泌、免疫网络的复杂调节,抗氧化应激可能不是其保护糖尿病代谢紊乱的唯一机制,褪黑素是否通过调节糖尿病时激活的HPA轴发挥稳定内环境、改善代谢紊乱的作用,目前尚无定论。中药制剂通络方剂（TLR）具有活血、通络、稳定细胞内皮的功能,其成分人参皂苷具有抗氧化作用。本研究通过观察褪黑素和通络方剂对实验性糖尿病大鼠糖、脂肪代谢及下丘脑-垂体-肾上腺轴激素表达的影响,探讨褪黑素和通络方剂对实验性糖尿病大鼠保护作用的可能机制。研究方法:采用链脲佐菌素（STZ）（65mg/kg腹腔注射）诱导糖尿病大鼠模型,大鼠随机分为5组,每组6-7只:糖尿病褪黑素大剂量处理组（DM+MEL 1）:褪黑素10mg/kg/d;糖尿病褪黑素小剂量处理组（DM+MEL2）:褪黑素0.2mg/kg/d;糖尿病通络方剂处理组（TLR）:通络方剂1g/kg/d（均为每日一次灌胃）:以及糖尿病对照组（DM）和正常对照组（NC）。实验周期为12周。1.检测各组大鼠体质量（BW）、双侧肾上腺质量/体质量（AW/BW）、血清总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）、血清丙二醛（MDA）和血糖。2.透射电镜下观察各组大鼠垂体促肾上腺皮质激素（ACTH）细胞和肾上腺皮质束状带细胞的超微结构。3.免疫组织化学方法检测垂体前叶促肾上腺皮质激素（ACTH）的表达。4.放射免疫法检测各组大鼠血中促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）、促肾上腺皮质激素（ACTH）、皮质酮（CORT）水平。结果:1.与正常对照组相比,DM组大鼠血糖水平、AW/BW、MDA、TC、TG水平显著升高（P＜0.01）,BW明显减轻（P＜0.01）;与DM组相比,DM+MEL1组和DM+MEL2组大鼠血糖、AW/BW、MDA、TC、TG显著降低（P＜0.01或P＜0.05）,BW明显升高（P＜0.01或P＜0.05）,TLR组大鼠MDA、TC、TG显著降低（P＜0.05）,血糖、AW/BW、BW无明显改变。2.垂体促肾上腺皮质激素细胞超微结构:糖尿病组较正常对照组出现明显改变,具体表现为:线粒体数量增多,部分嵴脱落,粗面内质网明显扩张,核周间隙出现,内分泌颗粒沿细胞质膜分布,颗粒大小、电子密度不等,数量明显增多;褪黑素治疗组与DM组相比,线粒体数量减少,嵴基本正常,粗面内质网扩张不明显,内分泌颗粒数量减少,大剂量褪黑素治疗组尤为明显,基本接近正常对照组;通络方剂治疗组较DM组无明显改变。3.肾上腺皮质束状带细胞超微结构:糖尿病组较正常对照组出现明显改变,具体表现为:管泡状嵴线粒体发达,体积较大,数量明显增多,部分脂质体周围绕以密集排列的线粒体,滑面内质网增生、扩张;褪黑素治疗组较糖尿病组明显改善,大剂量褪黑素组接近正常对照组;通络方剂治疗组与DM组相似。4.各组垂体组织ACTH表达免疫组化检测结果:与正常对照组相比,DM组ACTH灰度比值表达明显升高（P＜0.01）;与DM组相比,DM+MEL1组灰度比值表达明显下降（P＜0.01）;DM+MEL2组和TLR组灰度比值表达较DM组下降,差异无统计学意义。5.与正常对照组相比,DM组大鼠CRH、ACTH、CORT水平显著升高（P＜0.01）;与DM组相比,DM+MEL1组大鼠血CRH、ACTH、CORT水平显著降低（P＜0.01）,DM+MEL2组大鼠血CORT水平显著降低（P＜0.05）,DM+MEL2组大鼠血CRH、ACTH水平无明显改变,TLR组大鼠血CRH、ACTH、CORT水平无明显改变。结论:1.STZ腹腔注射诱导的糖尿病模型大鼠普通饲料喂养12周后,血MDA、TC、TG、血糖水平显著升高,褪黑素和通络方剂治疗后下降,提示氧化应激是其共同机制,抗氧化剂可以明显改善糖尿病时糖、脂肪代谢紊乱,通络方剂可能通过其成分人参皂苷发挥了抗氧化作用,具体机制需要进一步研究。2.糖尿病模型大鼠AW/BW和血CRH、ACTH、CORT水平均显著升高,提示糖尿病大鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴处于过度激活状态,进一步加重了内环境紊乱。褪黑素抑制血CRH、ACTH、CORT表达,且大剂量褪黑素效果优于小剂量褪黑素,对糖尿病急性代谢紊乱具有保护作用,其确切机制有待于进一步研究。3.透射电镜观察显示糖尿病组垂体ACTH细胞内内分泌颗粒明显增多,垂体组织ACTH免疫组化检测亦提示糖尿病组垂体细胞浆内ACTH表达增强,与放射免疫法检测血中ACTH水平结果一致。肾上腺皮质束状带细胞超微结构较正常对照组出现明显变化,提示皮质功能亢进。褪黑素治疗可以抑制这种改变。通络方剂无明显抑制作用。
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