论文摘要
研究背景周围神经损伤是临床上的难题,目前依然以自体神经移植修复为主要手段,但由于自体神经来源有限且供区有较多并发症,故多年来医学界不断寻找能替代自体神经移植的生物材料。在众多的替代材料中,去细胞异体神经显示了良好的应用前景。化学法萃取去细胞异体神经（Chemically ExtractedAcellular Nerve,CEAN）,在最大限度地去除免疫原性物质的同时,较好地保存神经内部结构和细胞外基质的活性成分,成为修复周围神经缺损理想材料之一。在我们前期的研究中,已经采用CEAN成功地修复了犬、猴的大段周围神经缺损,取得了良好效果,其有效修复长度范围可达8厘米。应用CEAN桥接周围神经损伤伤后,在再生神经纤维长入靶器官之前,患侧肌肉已发生严重萎缩,提高神经纤维再生速度,减轻肌肉萎缩对修复神经功能至关重要。此外,随着周围神经缺损长度的增加,神经修复效果降低,如何增加移植神经修复长度,已成为周围神经损伤研究重点之一。相关的研究发现,CEAN中存在有利于神经生长的成分,也有不利于神经再生的成分,将这些抑制神经再生的物质去除,并保留促神经再生的物质,将进一步提高CEAN修复周围神经缺损效果。研究目的1对大鼠CEAN蛋白成分进行电泳分析,了解CEAN中免疫原性蛋白残存情况;在CEAN切片上,接种背根神经节,观察CEAN结构对神经再生的影响。2为CEAN修复周围神经缺损补充缓释的外源性神经生长因子,观察该方法对神经再生生长速度、肌肉萎缩、神经组织再生情况的影响。3应用软骨素酶ABC去除CEAN中不利于神经再生的物质-硫酸软骨素蛋白多糖（Chondroitin Sulfate Proteoglycan,CSPG）,修复大鼠坐骨神经长距离缺损,评价去除CSPG对修复缺损距离的影响。研究方法第一部分CEAN蛋白成分及结构特性按Sondell法制备大鼠的CEAN,将制备好的CEAN进行电泳分析,观察28-30 kDa区域的髓鞘蛋白的残留情况;将CEAN进行冰冻切片,接种鸡胚背根神经节,进行神经纤维荧光染色,观察神经纤维在CEAN切片上的生长方向。第二部分神经生长因子（NGF）复合缓释制剂对提高CEAN修复周围神经缺损的实验研究采用复乳溶媒蒸发—萃取法,以聚乳酸羟基/乙酸共聚物为材料制备NGF微球,与纤维蛋白胶混合制备成补充外源性NGF复合缓释制剂。体外进行NGF复合缓剂药物释放曲线,与鸡胚背根神经节共培养鉴定释放NGF的活性。体内实验,以桥接大鼠坐骨神经10mm缺损为模型,分为自体神经移植组（A组）,CEAN+NGF复合缓释制剂组（B组）;CEAN移植组（C组）:CEAN移植+纤维蛋白胶组（D组）,术后两周测量神经再生生长距离,术后4个月进行神经电生理、腓肠肌湿重、计算机图像分析等方面评价神经移植后的再生效果。第三部分去除CEAN中的CSPG对修复周围神经缺损的实验研究CEAN经软骨素酶ABC降解CSPG后,进行免疫组化染色,观察CSPG去除效果和对去细胞异体神经其它成分的影响。经软骨素酶ABC处理后的CSPG修复周围神经缺损为实验组（A组）,桥接大鼠20mm周围神经缺损,对照组不作处理（B组）,术后3个月,评价其修复周围神经效果。研究结果第一部分:CEAN电泳结果显示:28-30kDa区域髓鞘蛋白完全消失,化学萃取的去细胞神经可以完全去除髓鞘蛋白;背根神经节发出大量的神经纤维沿着CEAN基底膜管方向生长;而CEAN切片外侧仅有少量神经纤维生长。第二部分:体外实验证明,NGF复合缓释制剂可持续释放NGF达60天以上,释出的NGF可促进鸡胚背根神经节神经纤维突起生长,具有较强的生物学活性。术后2周A组神经再生距离比其他组长（P＜0.05）,B组优于C和D组（P＜0.05）;C、D组间无差异无统计学意义（P＜0.05）。术后16周,A、B、C及D组小腿三头肌收缩力恢复率分别为85.33%±5.59%、69.79%±5.31%、64.46%±8.49%、63.35%±6.40%;A组优于其他3组（P＜0.05）,B、C、D组间差异无统计学意义（P＜0.05）。A、B、C及D组肌肉湿重恢复率分别为62.54%±8.25%、53.73%±4.56%、46.37%±5.68%、45.78%±7.14%;A组三头肌湿重恢复率好于其他3组（P＜0.05）,B组好于C和D组（P＜0.05）;C、D组间无差异无统计学意义（P＜0.05）。组织学图像分析结果为B组在有髓神经纤维数量,轴突直径,髓鞘厚度,均优于C、D组（P＜0.05）,轴突直径小于与A组（P＜0.05）。第三部分:CSPG免疫组化染色结果显示,软骨素酶ABC可以明显去除CSPG,并保留促神经生长的Laminin有效成分。动物实验结果显示,术后2个月,两组都出现残足情况,A组仅一只大鼠出现残足,而B组6只大鼠出现残足。据Wall自残标准评分,两组进行等级资料秩和检验,P＜0.05,两者之间具有统计学差异。术后3个月,A组6只大鼠5只出现钳夹痛觉试验阳性,而B组仅1只大鼠出现阳性反应。进行四格表卡方检验,x2=4.42,P＜0.05。两组之间具有显著性差异。在小腿三头肌肌张力恢复率和小腿三头肌肌湿重方面,两组比较,A组均优于B组。进行近端与远端吻合口HE染色A组神经纤维结构优于B组。结论1 CEAN中无残留引起免疫反应的髓鞘蛋白,保留的基底膜管结构对促神经纤维再生具有引导性作用。2 NGF复合缓释制剂可以保护NGF活性,可以提高CEAN修复周围神经缺损的神经再生速度。3软骨素酶ABC可以去除CEAN中CSPG,经软骨素酶ABC处理的CEAN可以增加修复周围神经缺损的长度。
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