论文摘要
蛋白质序列中丝/苏-脯氨酰基序的磷酸化是一个重要的细胞内信号机制,主要关系到细胞增殖和转化。近年来研究发现:磷酸化的丝/苏-脯氨酰基序还需要被Pin1特异识别催化,依赖Pin1的构型转变是新的蛋白磷酸化后调节机制,对细胞增殖和恶性转化起着非常重要的调节作用,其功能失调可导致细胞转化和肿瘤发生。Pin1在人类多种肿瘤中存在过表达,对多种致癌信号具有协同加强作用,被称为肿瘤发生发展的“催化分子”。Pin1过表达在实体瘤如乳腺癌、前列腺癌发生中起关键的催化作用,且与临床预后密切相关。宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤,属于实体瘤,是导致妇女发生癌相关死亡的首要原因。尽管宫颈癌发生的确切的分子机制并不清楚,但研究表明:HPV与宫颈癌关系密切,在HPV E6/E,致癌信号通路中,多种癌信号分子因含有共同的丝/苏-脯氨酰基序可能受Pinl特异性调控,如cyclin D1,Ki67,P53,NF-κB等,其中cyclin D1过度表达可加速细胞增殖,在HPV E6/E7致癌中扮演着重要角色,cyclin D1是HPV E6/E,致癌所必不可少的成分。体内、外研究显示:删除cyclin D1,则HPV E6/E7不能诱导正常细胞转化增殖。但cyclin D1过表达的机制不明。有趣的是Pin1过表达不仅在转录水平促进cyclin D1表达,而且还通过催化cyclin D1发生顺反异构,阻止其降解,导致cyclin D1蓄积于细胞核内,处于持续激活状态,加速乳腺上皮细胞增殖和肿瘤发生。推测Pin1可能也作为催化分子经上调cyclin D1参与宫颈癌发生,Pin1过表达过度激活cyclin D1可加强致癌信号、扰乱细胞内信号稳态,可能是引起宫颈上皮细胞发生恶性转化和增殖失控的重要因素。然而,Pin1在宫颈癌中表达及其与cyclin D1关系的研究尚未见报道,阻抑Pin1是否影响宫颈癌细胞增殖和肿瘤形成亦不清楚。因此本课题拟进行如下研究:目的:1.明确Pin1、cyclin D1在宫颈癌中的表达状况及其临床意义;2.研究Pin1在宫颈癌发生发展中可能的作用及对cyclin D1表达的影响;3.探索靶向Pin1基因沉默阻抑宫颈癌发生和细胞增殖的可能性。方法:1.免疫组织化学法检测57例宫颈癌,21例CIN,10例正常宫颈组织中Pinl,cyclin D1和Ki67的表达,分析其相关性及临床意义;同时RT-PCR法检测其中15例宫颈癌,5例正常宫颈组织中Pin1 mRNA的表达;2.RT-PCR,免疫印迹法和免疫细胞化学法检测4株宫颈癌细胞HeLa,Siha,C33a,Caski中Pin1 mRNA和蛋白的表达;3.构建Pin1正义质粒,上调Pin1基因表达;免疫印迹法,MTT比色法,软琼脂克隆形成实验,流式细胞仪分析上调Pin1基因对cyclin D1表达及宫颈癌细胞增殖、凋亡的影响;4.应用RNA干扰技术,短发夹状RNA特异性沉默Pin1基因表达;免疫印迹法,MTT比色法,软琼脂克隆形成实验,流式细胞仪分析下调Pin1基因对cyclinD1表达及宫颈癌细胞增殖、凋亡的影响。结果:1.宫颈癌组织中Pin1 mRNA和蛋白表达明显高于正常宫颈组织（P<0.05）;从正常宫颈到CIN再到浸润癌Pin1蛋白表达逐渐增强（p,0.05）;Pin1蛋白过表达与临床分期、病理分级、淋巴结转移无明显相关（p>0.05）;但宫颈腺癌中Pin1表达明显高于宫颈鳞癌（p<0.05）;Pin1过表达与cyclin D1,Ki67表达密切相关（p<0.05）。2.HeLa、Siha、C33a、Caski宫颈癌细胞株存在不同程度Pin1 mRNA及蛋白过表达（p<0.05）。3.在宫颈癌HeLa细胞中,上调Pinl可增加内源性cyclin D1表达,下调Pinl可降低内源性cyclin D1表达（p<0.05）。4.特异性沉默Pin1基因可阻抑宫颈癌细胞增殖并诱导凋亡（p<0.05）;外源性增加Pin1基因表达对宫颈癌细胞增殖和凋亡无明显影响（p>0.05）。结论:1.Pin1在宫颈癌组织和细胞中均存在mRNA及蛋白水平上的过表达,Pin1过表达与cyclin D1,Ki67表达密切相关,Pin1过表达与宫颈癌细胞增殖失控有关。2.Pin1表达异常可能参与宫颈癌的发生发展,其发挥促癌作用的分子机制之一是调节内源性cyclin D1表达。3.Pin1可能成为宫颈癌新的诊断和治疗靶点,以Pin1为靶向的RNA干扰技术有望应用于宫颈癌防治。
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