玉米MAPK基因家族的鉴定及ZmMPK4基因对的功能分析

论文摘要

促分裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase, MAPK）级联途径是真核生物中广泛存在的信号转导途径。促分裂原活化蛋白激酶级联途径由MAPKKK-MAPKK-MAPK依次磷酸化传递信号。MAPK级联途径各激酶基因家族在不同植物物种中是保守的。目前,玉米基因组测序已经完成,在基因组水平上解析玉米MAPK家族的信息已经成为可能。MAPK是连接底物和上游信号的重要因子。以前的研究表明,MAPK级联途径参与植物的ABA信号转导。但是,关于ABA信号中特异的MAPK基因的研究仍然很有限。本研究根据植物MAPK基因的保守性鉴定了玉米MAPK家族的基因。对玉米MAPK基因家族的分类、蛋白生化特性、基因结构、染色体分布、蛋白的系统进化以及基因在幼苗根、茎、叶中的表达模式进行了系统分析。在此基础之上,选取了ZmMPK4基因进行功能研究。ZmMPK4为双拷贝基因,和ZmMPK3是基因对,ZmMPK4基因对参与ABA信号转导。主要研究结果如下:（1）利用网络数据库的BLAST和本地Stand-alone BLAST的方法,鉴定了19个玉米MAPK基因。19个MAPK基因的氨基酸长度在369到642之间,分子量在42.199 kDa到72.444 kDa之间,等电点在5.26到9.82之间。6号和8号染色体各有4个MAPK基因,5号和9号各3个,10号2个,1号、3号、4号各1个。与双子叶拟南芥和杨树比较,玉米MAPK基因和水稻MAPK基因的亲缘关系比较近。（2）ZmMPK1和ZmMPK2的序列高度相似,数据库搜索表明,没有EST序列特异的和ZmMPK1匹配。RT-PCR分析表明,在玉米幼苗根、茎、叶中检测不到ZmMPK1的表达,说明ZmMPK1可能是一个假基因。其它18个基因在玉米幼苗根、茎、叶中都能检测到。除了ZmMPK12、ZmMPK18、ZmMPK19没有明显的组织特异性外,其它15个基因在玉米幼苗根、茎、叶中的分布均不同。（3）PCR分析表明,ZmMPK4和文献报道的ZmMPK4（命名为ZmMPK4-2）的序列不完全一致。ZmMPK4-2是ZmMPK4的一个可变剪接产物。基因测序和玉米MAPK基因家族的分析表明,ZmMPK4是双拷贝基因,ZmMPK3和ZmMPK4是基因对。Southern实验验证了ZmMPK4的拷贝数。ZmMPK3和ZmMPK4的核苷酸相似度为92.1%,编码氨基酸的相似度为90.0%。ZmMPK3和ZmMPK4分别位于1号染色体短臂和9号染色体长臂。两个基因都能形成mRNA和蛋白质。（4）序列分析表明,ZmMPK4的3号内含子是GC-AG型内含子。ZmMPK4-2是保留了ZmMPK4的3号内含子形成的可变剪接产物。ZmMPK4-2的组成型表达量非常低,主要在叶中表达。ZmMPK4也可以剪切3号内含子形成正常的ZmMPK4-1,且为ZmMPK4基因表达的主要方式。ZmMPK3的3号内含子为GT-AG型内含子。（5）Northern杂交实验表明,ZmMPK3主要在生长5日的幼苗叶中表达,ZmMPK4主要在幼苗根中表达。ZmMPK3和ZmMPK4都受ABA（100?M）和NaCl（200mM）的诱导,但诱导时间和表达量不同。但是,Northern杂交不能区分ZmMPK4-1和ZmMPK4-2。利用RT-PCR的方法,进一步分析了ZmMPK4-1和ZmMPK4-2的特异表达,结果显示,ZmMPK4-2主要在叶中表达,即ZmMPK4在幼苗中的可变剪接主要在叶中进行。ZmMPK4的可变剪接受ABA或NaCl的调控。（6）制备了ZmMPK3的抗体（Anti-ZmMPK3）。因为ZmMPK3和ZmMPK4的氨基酸序列高度相似,无法设计特异抗体。ZmMPK3和ZmMPK4的混合蛋白（约43kDa）在生长5d的玉米叶片中组成型表达,ABA（100?M）可以轻微诱导ZmMPK3和ZmMPK4混合蛋白的表达。免疫沉淀分析表明,ABA可以激活ZmMPK3和ZmMPK4混合蛋白的激酶活性（0.5h和1h）。用烟草叶片瞬时转化法分别检测ZmMPK3、ZmMPK4-1和ZmMPK4-2的活性,检测不到ZmMPK4-2的活性,而ZmMPK3或ZmMPK4-1的激酶活性都可以被ABA诱导。（7）洋葱表皮表达分析表明,ZmMPK3或ZmMPK4-1的融合蛋白主要定位于细胞膜和细胞核,而ZmMPK4-2融合蛋白主要定位于细胞膜和细胞质。ZmMPK4-2中的30个氨基酸的插入可能影响ZmMPK4的细胞定位。（8）过表达ZmMPK4-1可以促进拟南芥提前抽薹。在发育后期,转基因拟南芥的主茎上可以形成莲座叶,并可继续抽薹。在正常MS培养基上,过表达ZmMPK4-1的拟南芥和野生型拟南芥的萌发率没有明显差别（约为100%）。0.5?M的ABA可以抑制转基因和野生型拟南芥种子的萌发,但对转基因拟南芥的抑制明显强于野生型。正常生长条件下,ZmMPK4-1在转基因拟南芥中具有激酶活性。ABA（0.5?M）可以增强转基因拟南芥中ZmMPK4-1的激酶活性。过表达ZmMPK4-1可以诱导拟南芥AtACT1的组成型表达,可以增强AtACT2、ABI3、ABI5基因对ABA（0.5?M）的响应。

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1 前言

1.1 植物细胞信号转导

1.2 促分裂原活化蛋白激酶级联途径

1.3 植物MAPK 级联途径的功能

1.3.1 MAPK 级联途径在植物盐胁迫中的功能

1.3.2 MAPK 级联途径在植物干旱胁迫中的功能

1.3.3 MAPK 级联途径在植物温度胁迫中的功能

1.3.4 MAPK 级联途径在植物重金属胁迫中的功能

1.3.5 MAPK 级联途径在植物机械伤害中的功能

1.3.6 MAPK 级联途径与植物活性氧信号

1.3.7 MAPK 级联途径调控植物向重力性响应

1.3.8 MAPK 级联途径调控植物气孔发育

1.3.9 MAPK 级联途径调控植物胞质分裂

1.3.10 MAPK 级联途径与ABA 信号转导

1.4 基因的可变剪接

1.5 生物信息学和基因家族研究

1.5.1 生物信息学及其应用

1.5.2 基因家族的进化

1.6 本研究的目的及意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 植物材料

2.1.2 材料培养与处理

2.1.3 菌株与质粒

2.1.4 生化试剂

2.1.5 PCR 实验引物

2.1.6 生物信息学软件和网络资源

2.2 实验方法

2.2.1 本地BLAST 方法

2.2.2 Clustal 软件的使用

2.2.3 MEGA 5.0 软件的使用

2.2.4 DANMAN 软件的使用

2.2.5 RNA 的提取

2.2.6 RNA 的纯化

2.2.7 cDNA 第一条链的合成

2.2.8 双链cDNA 的合成

2.2.9 连接反应

2.2.10 大肠杆菌感受态细胞的制备

2.2.11 大肠杆菌感受态细胞的转化

2.2.12 质粒DNA 的提取

2.2.13 质粒DNA 的酶切鉴定与回收

2.2.14 表达载体的构建

2.2.15 根癌农杆菌GV3101 感受态细胞的制备与转化

2.2.16 农杆菌介导的拟南芥转化

2.2.17 农杆菌介导的烟草瞬时转化

2.2.18 转基因拟南芥的鉴定

2.2.19 Northern 杂交分析

2.2.20 CTAB 法提取玉米基因组

2.2.21 Southern 杂交

2.2.22 Western 杂交

2.2.23 免疫沉淀

3 结果与分析

3.1 玉米MAPK 基因的鉴定

3.2 玉米MAPK 基因的结构分析

3.3 玉米MAPK 基因的分布

3.4 玉米MAPK 基因家族的系统发生分析

3.5 玉米MAPK 基因家族的表达分析

3.6 ZmMPK4 基因的序列分析

3.7 ZmMPK4 基因的拷贝数分析

3.8 ZmMPK4 基因对在玉米中的表达分析

3.8.1 ZmMPK4 基因对的组织表达模式

3.8.2 ZmMPK4 基因对在ABA 和NaCl 处理条件下的表达模式

3.9 ZmMPK4 基因对编码蛋白和激酶活性分析

3.10 ZmMPK4 基因对融合蛋白的亚细胞定位

3.11 过表达ZmMPK4-1 基因拟南芥的鉴定和表型分析

3.12 过表达ZmMPK4-1 基因拟南芥种子萌发过程中对ABA 的响应

3.13 过表达ZmMPK4-1 基因拟南芥植株中ABA 响应基因的表达

3.14 转基因拟南芥植株中ZmMPK4-1 蛋白和激酶活性分析

4 讨论

4.1 玉米MAPK 基因是一个多基因家族

4.2 玉米MAPK 基因家族在幼苗根、茎、叶中的表达

4.3 ZmMPK4 的拷贝数和可变剪接

4.4 ZmMPK3、ZmMPK4-1、ZmMPK4-2 对ABA 或NaCl 的响应

4.5 ZmMPK3、Zm MPK4-1、ZmMPK4-2 对ABA 的响应和亚细胞定位

4.6 过表达ZmMPK4-1 基因促进拟南芥发育和增强拟南芥对ABA 的敏感性

5 结论

参考文献

致谢

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