紫杉醇高产菌株和细胞系的选育

论文摘要

紫杉醇是一种高效、低毒、广谱的天然抗癌药物。药源紧缺。红豆杉细胞培养和产紫杉醇真菌发酵生产紫杉醇是最有可能解决紫杉醇药源问题的途径,但红豆杉细胞高产不稳定和产紫杉醇真菌紫杉醇产量低等因素制约了其产业化的应用。通过分子育种技术,将紫杉醇合成关键酶基因或者调控紫杉醇合成的转录因子基因导入红豆杉细胞或者产紫杉醇的真菌中,获得紫杉醇高产且生产特性稳定的红豆杉细胞系和菌株是解决以上问题的主要手段。因此,本研究以紫杉醇合成关键酶基因为分子标记高通量筛选产紫杉醇野生真菌,并优化其发酵条件以提高紫杉醇产量;并利用基因工程手段对红豆杉细胞和筛选获得的产紫杉醇真菌进行分子育种,获得紫杉醇高产且生产特性稳定的转关键酶基因的红豆杉细胞系和真菌菌株;再在克隆紫杉醇合成关键酶基因的启动子基础上,克隆并转化调控紫杉醇高产稳定合成的转录因子,构建诱导可控表达该转录因子的转基因红豆杉细胞系和产紫杉醇真菌。本研究取得如下创新性成果:（1）建立了一种以紫杉醇合成关键酶10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10-O-乙酰基转移酶（DBAT）和C-13苯丙氨基侧链CoA乙酰基转移酶（BAPT）基因为分子标记,基于PCR扩增技术高通量快速筛选产紫杉醇内生真菌的方法,极大地简化了筛选过程,提高了筛选效率,突破了传统筛选方法耗时费力却不易取得结果的不足。（2）利用该方法筛选获得三株产紫杉醇较高的内生真菌MD2、MD3和YN6,并根据形态特征、生理生化特征以及18S rDNA序列分析等,分别鉴定为枝状枝孢霉、亮白曲霉和拟盘多毛孢属真菌,其中,枝状枝孢霉MD2、亮白曲霉MD3是该种内首次被作为产紫杉醇真菌报道的菌株。枝状枝孢霉MD2、亮白曲霉MD3和拟盘多毛孢YN6在300 ml PDL培养基中,25℃、180rpm摇瓶振荡发酵培养10天,紫杉醇产量分别为160μg/L,112μg/L和140μg/L,为目前紫杉醇产量较高的野生菌株。（3）首次从产紫杉醇真菌枝状枝孢霉MD2、亮白曲霉MD3和拟盘多毛孢YN6中克隆了10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10-O-乙酰基转移酶全基因（dbat）,DNA序列分析表明,它们和红豆杉的dbat基因有着很高的同源性。这也是首次关于产紫杉醇内生真菌的10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10-0-乙酰基转移酶基因的报道。（4）对影响枝状枝孢霉MD2、亮白曲霉MD3合成紫杉醇的培养温度,发酵液初始pH、摇床转速等发酵条件进行了探讨,确定了较适发酵条件,并通过研究四种前体物对枝状枝孢霉MD2、亮白曲霉MD3合成紫杉醇的影响,初步优化了培养基。以优化后的发酵培养基发酵,枝状枝孢霉MD2和亮白曲霉MD3的紫杉醇产量分别提高到569.5μg/L和497.3μg/L,比原始条件下产量分别提高了356%和444%。（5）采用根癌农杆菌LBA4404介导,以紫杉醇产生菌株枝状枝孢霉MD2分生孢子为受体材料,对影响转化效率的主要因素,如:农杆菌生长时期、初始菌液量、共培养温度和时间,以及乙酰丁香酮的添加阶段和剂量等因素进行了分析,确定了采用根癌农杆菌LBA4404介导转化枝状枝孢霉MD2的最适条件,建立了根癌农杆菌介导产紫杉醇内生真菌枝状枝孢霉MD2的遗传转化体系。（6）通过从曼地亚红豆杉细胞和长春花叶片中分别克隆dbat基因和orca3基因,以双元载体pCAMBIA1303为基本骨架,分别成功构建了包含紫杉醇合成关键酶基因dbat基因和来自长春花的转录调控因子orca3基因的一价、二价载体,转化曼地亚红豆杉细胞和枝状枝孢霉MD2、亮白曲霉MD3,获得了转化子。导入dbat基因的枝状枝孢霉MD2、亮白曲霉MD3转化子的紫杉醇产量提高至860μg/L和750μg/L,较野生菌株紫杉醇产量各提高了1.5倍。导入dbat基因的曼地亚红豆杉细胞转化子的紫杉醇产量提高至923.5μg/L,提高了1.3倍。导入dbat基因的枝状枝孢霉MD2、亮白曲霉MD3转化子的紫杉醇产量提高的结果,首次证明了dbat基因在这两株产紫杉醇内生真菌中是紫杉醇合成的关键酶基因。（7）在红豆杉细胞和产紫杉醇内生真菌枝状枝孢霉MD2、亮白曲霉MD3中转化和表达orca3基因,发现该转录因子对紫杉醇合成的调控是负调控,导入orca3基因的枝状枝孢霉MD2、亮白曲霉MD3和曼地亚红豆杉细胞转化子的紫杉醇产量都有明显降低。（8）通过随机引物PCR方法和单边特异引物结合的半巢式PCR扩增（hemi-nestedPCR amplification）方法,首次分离和克隆了dbat基因的5’-侧翼序列,并在烟草叶片中进行了瞬时表达验证其启动子功能。进一步克隆并转化调控紫杉醇高产稳定合成的转录因子,构建诱导可控表达该转录因子的转基因红豆杉细胞系和产紫杉醇真菌。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 紫杉醇及其来源
• 1.1.1 天然红豆杉植物中提取紫杉醇
• 1.1.2 化学全合成紫杉醇
• 1.1.3 生物/化学半合成生产紫杉醇
• 1.1.4 红豆杉细胞培养生产紫杉醇
• 1.1.5 从红豆杉近缘科属植物提取紫杉醇
• 1.1.6 微生物发酵法生产紫杉醇
• 1.2 紫杉醇的生物合成途径
• 1.3 紫杉醇生物合成的酶及基因
• 1.4 提高紫杉醇产量的途径
• 1.5 红豆杉及产紫杉醇真菌的遗传转化
• 1.5.1 真核生物的转化方法
• 1.5.2 红豆杉及产紫杉醇真菌的遗传转化研究进展
• 1.6 构建紫杉醇高产细胞株的ATMT技术
• 1.6.1 根癌农杆菌的转化机理
• 1.6.2 农杆菌载体的构建
• 1.6.3 影响T-NDA转移的因素
• 1.7 紫杉醇合成的转录调控
• 1.7.1 转录因子对植物次生代谢的调节作用及机理
• 1.7.2 研究转录因子的方法
• 1.8 本研究的主要内容及目的
• 2 产紫杉醇真菌的筛选
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 3 产紫杉醇真菌的鉴定
• 3.1 引言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 材料
• 3.2.2 方法
• 3.3 结果
• 3.3.1 菌株MD2的形态特征和鉴定
• 3.3.2 菌株MD3的形态特征和鉴定
• 3.3.3 菌株YN6的形态特征和鉴定
• 3.3.4 dbat基因全长的扩增和分析
• 3.4 讨论
• 4 产紫杉醇真菌发酵条件的初步优化
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 材料
• 4.2.2 方法
• 4.3 结果
• 4.3.1 培养基的选择
• 4.3.2 pH对紫杉醇合成的影响
• 4.3.3 温度对紫杉醇合成的影响
• 4.3.4 摇床转速对紫杉醇合成的影响
• 4.3.5 培养时间与紫杉醇产量的关系
• 4.3.6 前体物对紫杉醇合成的影响
• 4.4 讨论
• 5 农杆菌介导转化体系的建立
• 5.1 引言
• 5.2 材料和方法
• 5.2.1 材料
• 5.2.2 根癌农杆菌介导的遗传转化体系的建立
• 5.3 结果
• 5.3.1 MD2对潮霉素、头孢菌素的敏感性实验
• 5.3.2 转化子的PCR检测
• 5.3.3 共培养温度对MD2转化的影响
• 5.3.4 孢子浓度对转化的影响
• 5.3.5 农杆菌生长时期及初始菌量对转化的影响
• 5.3.6 共培养时摇床转速对转化的影响
• 5.3.7 共培养时间对转化的影响
• 5.3.8 乙酰丁香酮对转化的影响
• 5.4 讨论
• 6 紫杉醇高产转基因细胞系和菌株选育
• 6.1 引言
• 6.2 材料和方法
• 6.2.1 材料
• 6.2.2 方法
• 6.3 结果
• 6.3.1 载体的构建
• 6.3.2 潮霉素、头孢菌素对亮白曲霉MD3、曼地亚红豆杉细胞生长的影响
• 6.3.3 转基因菌株、细胞株的遗传转化分析
• 6.4 讨论
• 7 dbat基因启动子的克隆与鉴定
• 7.1 引言
• 7.2 材料和方法
• 7.2.1 材料
• 7.2.2 dbat基因5’-侧翼序列的扩增
• 7.2.3 启动子活性检测分析
• 7.3 结果
• 7.3.1 dbat基因5’-侧翼序列的扩增
• 7.3.2 zd-p功能鉴定
• 7.3.3 napin基因启动子的克隆和分析
• 7.4 讨论
• 8 结论与展望
• 致谢
• 参考文献
• 攻读博士期间发表、拟发表文章和专利