猪戊型肝炎病毒抗体ELISA检测方法的建立及其上海地区HEV分子流行情况的调查

论文摘要

戊型肝炎（Hepatitis E,HE）,是由戊型肝炎病毒毒（Hepatitis E Virus,HEV）引起的一种人和多种动物的人兽共患病。一般在亚洲和非洲一些卫生条件较差的发展中国家暴发流行,发达国家则呈散发,我国是主要流行国家。HEV的可以感染多种动物,其中猪是非常重要的宿主,在跨种间感染与传播中起着重要作用。本研究以上海地区猪戊型肝炎主要流行株为标本,以RT-nPCR扩增ORF2基因目的片段,并将其插入到pMD-18 T 5imple载体中,构建克隆载体pMD-ORF2。克隆的基因片段长666 bp,编码222个氨基酸。与部分不同基因型代表株氨基酸序列比对分析发现,与基因型4的同源性最高,亲水性和抗原性较好。对克隆载体pMD-ORF2进行双酶切,将得到的666bp片段以正确的阅读框架定向克隆于pET-30a（+）中,然后将重组质粒转化进宿主菌BL21中,在37℃IPTG诱导1.0 h下该片段获得良好表达。经SDS-PAGE鉴定,其表达的融合蛋白约为33 kD,与预期值相符。经Ni-亲和层析柱纯化后,得到单一的目的蛋白条带。免疫转印试验显示,该重组蛋白可被猪或人HE阳性血清识别,表明该重组蛋白具备HEV天然毒株抗性,且与人HEV存在抗体交叉反应性.重组蛋白尿素洗涤上清作SDS-PAGE和Westernblot,均显示表达的蛋白有良好抗原性。以LHEV中国猪源株ORF2（394-617 aa）基因工程表达蛋白作为包被杭原,猪HEV阳性血清作为第一抗体,以HRP标记的PSA（HRP-SPA）代替酶标抗体作间接ELISA来检测猪血清中的HEV lgG。方阵滴定试验确定,蛋白的最佳包被浓度约为2μg/孔,猪血清的最佳稀释度为1:100,HRP-SPA代替酶标二抗其工作浓度为1:10000,从而建立了间接ELISA方法。随机选取87份猪血清,分别用所建立试剂盒和HEV总抗体检测试剂盒（北京万泰抗原夹心法）两种方法检测HEV,结果表明所建立试剂盒检出IgG 70份阳性（阳性率为80.4%）,万泰试剂盒检出64份IgM及IgG阳性（阳性率为73.5%）,两种方法的符合率为91.4%（70/64）。用所建立试剂盒检测采自上海周边地区猪场的553份猪血清样本中的HEV IgG抗体,调查上海地区HEV的感染状况。结果表明,总阳性率64.56%（357/553）。采取上海猪场61份猪粪,进行RT-PCR检测,检测到10份阳性,测序发现10个克隆均为4型,说明上海主要流行株是基因4型。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 缩略词
• 第一章 猪戊型肝炎病毒的研究进展
• 1 目前对猪戊型肝炎的研究进展
• 1.1 猪戊型肝炎病毒研究进展
• 1.2 临床症状和病理变化
• 1.3 实验室检测方法及免疫反应
• 1.4 预防及HEV疫苗的研究
• 2 目前存在的问题
• 3 研究的目的和意义
• 第二章 ORF2片段的克隆及其序列分析
• 1 材料
• 1.1 毒株
• 1.2 菌株、质粒和血清
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要仪器
• 1.5 引物设计
• 2 方法
• 2.1 用具处理
• 2.2 粪便样品的处理
• 2.3 病毒RNA的提取
• 2.4 目的基因的扩增和克隆
• 2.5 PCR产物的T/A连接
• 2.6 连接产物的转化
• 2.7 重组质粒pMD-ORF2的酶切鉴定和PCR鉴定
• 3 结果
• 3.1 所选片段抗原性及亲水性分析
• 3.2 目的基因的扩增
• 3.3 序列测定结果
• 4 讨论
• 第三章 抗原蛋白的表达及其间接ELISA的建立
• 1 材料
• 1.1 主要试剂
• 1.2 主要仪器
• 1.3 引物
• 2 方法
• 2.1 RT-PCR扩增目的片段
• 2.2 目的片段的回收纯化
• 2.3 目的片段和表达载体质粒的酶切
• 2.4 重组质粒的筛选及鉴定
• 2.5 诱导表达并鉴定
• 2.6 Western-blot检测重组蛋白的抗原性
• 2.7 重组蛋白的纯化及检测
• 2.8 用纯化的抗原免疫兔子
• 2.9 间接法抗HEV-IgG EUSA
• 3 结果
• 3.1 目的片段的酶切鉴定
• 3.2 不同时相融和蛋白的表达
• 3.3 用MagExtractor-His-tag-kit纯化蛋白结果
• 3.4 Western blot鉴定结果
• 3.5 融合蛋白间接ELISA方法的建立
• 3.5.1 最佳蛋白包被浓度和血清稀释度的确定
• 3.5.2 最佳HRP标记的羊抗猪IgG的稀释度的确定
• 3.5.3 抗原抗体最佳反应时间的确定
• 3.5.4 HRP标记的羊抗猪IgG最佳反应时间的确定
• 3.5.5 重复性试验
• 3.5.6 间接ELISA结果及临界值判定
• 3.5.7 特异性实验结果
• 3.5.8 底物作用时间的确定
• 3.5.9 商品化试剂盒检测结果
• 4 讨论
• 5 小结
• 第四章 上海猪场戊型肝炎病毒抗体和抗原在动物体中的检测
• 1 材料
• 1.1 主要试剂和仪器
• 1.2 血清和粪便样品来源
• 2 方法
• 2.1 戊肝病毒抗体的检测
• 2.2 戊肝病毒RNA的检测
• 2.2.1 引物设计
• 2.2.2 RNA提取
• 2.2.3 目的基因的扩增和克隆
• 2.2.4 PCR产物鉴定
• 2.2.5 PCR鉴定
• 2.2.6 测序及序列分析
• 3 结果
• 3.1 血清中抗-HEV抗体
• 3.2 HEV RNA的检测
• 3.3 测序结果分析
• 3.4 系统遗传进化分析
• 4 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 在读研期间已发表文章