放线菌新抗生素生物合成基因的发掘

论文摘要

木试验从采自北京、湖南、湖北、广州、吉林5个地区的31份土样中共分离放线菌303株,从抗菌活性、甲醇提取物紫外可见吸收光谱及次生代谢基因等方面进行了研究。以金黄色葡萄球菌（Staphlococcus aureus）、花生青枯病菌（Pseudomonas glumae）、胡萝卜软腐欧文氏病菌（Erwinia carotovora）、水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）为指示菌,测定了分离的303株放线菌的抑菌活性。结果显示：共有39株放线菌表现出了抗细菌活性,其中有30株、19株和18株放线菌分别对花生青枯病菌（P. glumae）、欧文氏胡萝卜软腐病菌（E. carotovara）和金黄色葡萄球菌（S. aureus）表现出抑菌活性,14株放线菌对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有作用。共有53株放线菌显示抗真菌活性,其中48株对水稻纹枯病菌（R. solani）有抑菌活性,25株对油菜菌核病菌（S. sclerotiorum）有抑菌活性,有19株对水稻纹枯病菌（R. solani）和油菜菌核病菌（S. sclerotiorum）均有抑菌活性。测定了所分离放线菌甲醇提取物紫外-可见光谱,根据最大吸收峰和吸收曲线特性,将放线菌划分为19个类群。结合抑菌活性筛选和聚酮合酶（PKS）基因和非核糖体肽合成酶（NRPS）基因PCR检测结果,发现吸收峰与抑菌活性以及PKS和NRPS基因有一定的相关性。利用聚酮合酶（PKS）基因和非核糖体肽合成酶（NRPS）基因简并引物对生物合成基因簇检测。在分离到的303株放线菌中,有10个菌株扩增出约700bp的Ⅱ型PKS基因片段,有2个菌株扩增出700bp左右的NRPS基因片段,BLAST比对结果表明这些基因簇可能能够合成新化合物,预测蛋白序列显示,44和126菌株可能能够合成Angucycline类抗生素。根据16SrDNA基因BLAST比对结果及电镜扫描结果,鉴定46号菌株应为链霉菌属。本试验获得重组质粒pWXl,为下一步生物合成基因簇的克隆奠定了研究基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1. 前言
• 1.1 放线菌概述
• 1.2 放线菌基因组研究概况
• 1.2.1 天蓝链霉菌[Streptomyces coelicolor A3（2）]基因组
• 1.2.2 除虫链霉菌（Streptomyces avermitilis）
• 1.3 放线菌次生代谢的遗传特征
• 1.3.1 聚酮类次生代谢的生物合成
• 1.3.2 非核糖体多肽类的生物合成（NRPS合成途径）
• 1.4 新抗生素发现的策略
• 1.4.1 稀有放线菌的分离
• 1.4.2 抗菌活性筛选
• 1.4.3 生物技术途径对新抗生素的发掘
• 1.4.4 组合生物合成
• 1.5 研究目的与意义
• 2. 材料与方法
• 2.1 试验材料与土样采集地点
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 质粒
• 2.1.3 引物
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 抗生素
• 2.1.6 酶和生化试剂
• 2.1.7 试验仪器
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 土壤放线菌的分离和筛选方法
• 2.2.1.1 土样的采集
• 2.2.1.2 土样的预处理
• 2.2.1.3 稀有放线菌的分离
• 2.2.1.4 放线菌的纯化和保藏
• 2.2.1.5 活性测定
• 2.2.2 大肠杆菌（Escherichia coli）质粒的提取（Sambrook and Russell,2001）
• 2.2.3 大肠杆菌的转化
• 2.2.3.1 E.coli的Ca2+法感受态的制备及转化（Sambrook and Russell,2001）
• 2.2.3.2 E.coli电击感受态的制备（Sambrook and Russell,2001）
• 2.2.3.3 大肠杆菌于放线菌间的结合转移操作流程（Flett et al.,1997）
• 2.2.4 放线菌孢子悬液的制备
• 2.2.5 放线菌基因组DNA的小量提取（Kieser et al.,2000）
• 2.2.6 PCR扩增反应
• 2.2.7 琼脂糖凝胶电泳
• 2.2.8 DNA的体外操作
• 2.2.8.1 DNA的体外连接反应
• 2.2.8.2 基因组DNA酶切及回收
• 2.2.9 测序及序列分析
• 2.2.10 系统发育树分析
• 2.2.11 分离放线菌代谢物质的光谱谱析方法
• 2.2.12 扫描电镜样品的制备
• 3. 结果与分析
• 3.1 土壤放线菌的分离及拮抗筛选
• 3.1.1 土壤放线菌的分离
• 3.1.2 土壤放线菌活性筛选结果
• 3.1.3 小结
• 3.2 放线菌菌株甲醇提取物的光谱谱析与基因组信息普查
• 3.2.1 放线菌菌株甲醇提取物的光谱谱析
• 3.2.2 分离放线菌基因组信息普查
• 3.2.2.1 放线菌基因组DNA的提取
• 3.2.2.2 放线菌基因组DNA的PCR检测
• 3.2.2.3 扩增出的PKSⅡ聚酮合成酶基因片段的序列分析
• 3.2.2.4 扩增出得NRPS基因片段序列分析
• 3.2.2.5 部分菌株的初步鉴定
• 3.2.2.6 小结
• 3.3 Ⅱ型聚酮合成基因簇的克隆
• 3.3.1 基因簇体内重组克隆策略
• 3.3.2 重组克隆基因簇的选择
• 3.3.3 重组质粒pWX1的构建
• 3.3.4 重组质粒pWX1接合转移导入Streptomyces sp.44
• 3.3.5 Streptomyces sp.44Ⅱ型聚酮合成基因簇的克隆
• 3.3.6 小结
• 4. 讨论
• 参考文献
• 附表1.Ⅱ型PKS序列
• 附表2.紫外扫描部分图谱
• 致谢