刺参（Apostichopus japonicus）感染两种病原菌前后体内凝集素的分离纯化与性质研究

论文摘要

凝集素（lectin）是一类具有糖专一性,可促使细胞凝集的蛋白质或糖蛋白,其研究历史已有一百多年。凝集素可与生物体内大量功能各异的糖复合物结合,形成一系列生物学功能。在动物和植物体内,凝集素又有一些不同的功能。凝集素的独特的生物学功能为其应用开辟了广阔的前景。早期对凝集素的研究多集中于高等植物。2001年, Yeaton在103种无脊椎动物体内发现了凝集素的存在,并推断在所有无脊椎动物体内可能都有凝集素。凝集素除了存在于甲壳动物、软体动物等无脊椎动物的血清中,也常常吸附在血细胞的细胞膜上。仿刺参（Apostichopus japonicus）属于棘皮动物门（Echinodermata）海参纲（Holothuroidea）楯手目（Aspidochirota）刺参科（Stichopodidae）仿刺参属（Apostichopus）。仿刺参为温带种,在我国主要分布于辽宁、河北、山东和江苏等沿海省份。仿刺参营养丰富,体壁含有丰富的胶原成分和蛋白聚糖,还含有大量的黏蛋白及多种氨基酸。最近有研究证明仿刺参含有防衰老的酸性粘多糖（硫酸软骨素）,具有较广的抗肿瘤及抗凝血的作用,并具有增强机体免疫功能的作用,是一种药用价值极高的海洋生物。仿刺参作为一种无脊椎动物,一般认为缺少适应性免疫,其“非己”识别免疫功能存在于某些特性的、可溶的或与细胞膜结合的模式识别受体（pattern recognition receptors , PRRs）,也成为模式识别蛋白（pattern recognition proteins , PRPs）或模式识别分子（ pattern recognition molecules ,PRMs）,这种模式识别受体就包含凝集素。因此,凝集素在仿刺参体内起着重要的免疫功能。当仿刺参受到病原及其它外界条件影响时,体内产生免疫反应,因此其体内凝集素的量必将与正常状况下有所不同。20世纪80年以来,我国的海水养殖业逐渐振兴并发展迅速,鱼类、海珍品类的增养殖进入快速发展时期。仿刺参人工育苗,年产量猛增数千万头,仿刺参增养殖在山东、辽宁等地初具规模。随着国内仿刺参养殖业的迅速发展,养殖面积的迅速扩张以及集约化养殖方式下的不规范操作,养殖过程中相继出现一系列病害问题,给仿刺参养殖业带来了巨大的损失。仿刺参“烂皮病”因其高传染性、高死亡率成为刺参养殖病害研究的重点。其发病特征一般为:感染初期刺参口部先出现感染症状,表现为围口膜松弛,触手对外界刺激反应迟钝,继而出现排脏现象;感染中期刺参身体收缩、僵直,口腹部出现小面积溃疡,形成蓝白色小斑点,逐渐丧失摄食能力;感染末期刺参的病灶变大,溃疡处增多,表皮腐烂面积变大,最后导致刺参死亡,溶化成鼻涕状胶体。本文利用本实验室已分离出的两种刺参烂皮病病原菌（Tenacibaculum属和Vibrionales属）对健康个体进行感染,分别分离纯化其凝集素,利用动物的红细胞对其凝集素的凝集活性分别进行检测,并进行分子量、含糖量、最适pH、耐热性等性质的研究,以期为仿刺参的免疫机制研究及药用研究提供科学的数据参考。研究方法及结果为:仿刺参经磷酸盐缓冲溶液抽提,20 %～75 %硫酸铵分级沉淀, DEAE-Sepharose F.F.和Sephadex G-100柱层析,得到仿刺参凝集素（AJL）。经SDS-PAGE显示单一条带,亚基相对其分子量为31 kDa。分别提取感染Tenacibaculum属和Vibrionales属病原菌的仿刺参凝集素,感染Tenacibaculum属病菌仿刺参的凝集素产量较大,但凝集兔红细胞的作用均不被D-果糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、棉子糖所抑制,而仅被牛甲状腺球蛋白所抑制,其中,感染Tenacibaculum属病菌仿刺参的凝集素更易受到牛甲状腺球蛋白的抑制。凝集兔红细胞的作用均不被二价金属离子Ca2 +、Mg2 +、Mn2+、Zn2+及EDTA所抑制。在pH 4. 0～10. 14系列缓冲液中均有活性,其中在pH 4. 4～7. 5范围内血凝性最高。该凝集活性在90℃加热30 min后仍然对红细胞有凝集活性,显示出较高的热稳定性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 凝集素研究现状
• 1.1 凝集素简介
• 1.2 凝集素的分布
• 1.3 凝集素的结构
• 1.4 凝集素的分类
• 1.5 凝集素的特性
• 1.5.1 能特异性地与受体结合
• 1.5.2 能改变受体物质的生物学特性
• 1.6 凝集素在生物学研究中的应用
• 1.6.1 凝集素可用于恶性肿瘤等疾病的诊断
• 1.6.2 利用凝集素来设计抗菌、抗病毒药物
• 1.6.3 利用凝集素设计“生物导弹”
• 2 仿刺参研究现状
• 2.1 海参简介
• 2.1.1 分类地位
• 2.1.2 生活习性
• 2.1.3 种类与分布
• 2.2 仿刺参简介
• 2.2.1 仿刺参的分类地位
• 2.2.2 形态特征
• 2.2.3 仿刺参分布
• 2.2.4 生活习性
• 2.2.5 生活史
• 2.2.6 营养价值
• 2.3 仿刺参养殖业及其对生态环境的影响
• 2.3.1 仿刺参养殖业的发展
• 2.3.2 养殖仿刺参业对生态环境的影响
• 2.4 仿刺参养殖业病害问题
• 2.4.1 研究现状
• 2.4.2 病害类型
• 3 研究目的和意义
• 第二章 致病菌感染实验
• 1 实验材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验仪器设备
• 1.3 实验药品
• 1.4 培养基配方
• 1.5 制备菌悬液
• 1.6 准备致病菌感染场所
• 1.7 仿刺参的前处理
• 1.8 加入菌悬液
• 1.9 观察记录
• 2 实验结果及讨论
• 2.1 致病菌感染健康仿刺参
• 2.2 讨论
• 3 小结
• 第三章 仿刺参凝集素（AJL）的分离纯化与性质鉴定
• 1 实验材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验仪器设备
• 1.3 实验药品
• 1.4 可溶性蛋白质浓度测定
• 1.5 凝集素活力测定方法
• 1.6 凝集素纯化鉴定路线
• 1.7 凝集素分离纯化
• 1.7.1 试剂配制
• 1.7.2 粗提液制备
• 1.7.3 硫酸铵分级
• 1.7.4 DEAE-离子交换层析
• 1.7.5 Sephadex G-100凝胶过滤层析
• 1.8 凝集素性质鉴定
• 1.8.1 试剂配制
• 1.8.2 亚基分子量的测定
• 1.8.3 血凝活性的测定
• 1.8.4 热稳定性试验
• 1.8.5 pH 对血凝活性的影响
• 1.8.6 EDTA 及二价金属离子对血凝活性的影响
• 1.8.7 糖抑制实验
• 2 实验结果及讨论
• 2.1 实验结果
• 2.1.1 凝集素的纯化
• 2.1.2 仿刺参凝集素亚基分子量
• 2.1.3 3种仿刺参凝集素的血凝活性
• 2.1.4 热稳定性
• 2.1.5 pH 对3组凝集素血凝活性的影响
• 2.1.6 EDTA 及金属离子对3组凝集素血凝活性的抑制作用
• 2.1.7 糖抑制试验
• 2.2 凝集素纯化方法讨论
• 2.2.1 有关硫酸铵分级范围
• 2.2.2 关于离子柱层析
• 2.2.3 关于分子筛层析
• 2.3 关于凝集素性质鉴定
• 2.3.1 亚基分子量的确定
• 2.3.2 关于温度、pH 对凝集素活性的影响
• 2.3.3 抑制实验
• 2.4 制备红细胞悬液的注意事项
• 3 小结
• Chapter Ⅰ Literature Review
• 1 Researching Status of Lectin
• 1.1 About Lectin
• 1.2 Distribution
• 1.3 Structure
• 1.4 Classification
• 1.5 Characteristic
• 1.5.1 Combining with receptor specifically
• 1.5.2 Change receptor’characteristic
• 1.6 Application of Lectin in Biology Research
• 1.6.1 Diagnosis of malignant tumor
• 1.6.2 Design the antibiont and antiviral drug by the lectin
• 1.6.3 Design "biological missile" by lectin
• 2 Present researches of Apostichopus japonicus
• 2.1 Brief introduction of sea cucumber
• 2.1.1 Status
• 2.1.2 Habit
• 2.1.3 Species and distribution
• 2.2 Brief introduction of Apostichopus japonicus
• 2.2.1 Status
• 2.2.2 Morphological Characteristics
• 2.2.3 Distribution
• 2.2.4 Habit
• 2.2.5 Life history
• 2.2.6 Nutritional value
• 2.3 Rearing industry of Apostichopus japonicus and the environment
• 2.3.1 Development of rearing industry
• 2.3.2 Influence on ecological environment
• 2.4 Diseases of rearing industry
• 2.4.1 Researching Status
• 2.4.2 Type of diseases
• 3 The purpose and significance
• Chapter Ⅱ Infect Apostichopus japonicus by two pathogens
• 1 Materials and Methods
• 1.1 Materials
• 1.2 Equipments
• 1.3 Reagents
• 1.4 Formula of medium
• 1.5 Prepare suspension of bacteria
• 1.6 Prepare places for infection
• 1.7 Pre-treatment of Apostichopus japonicus
• 1.8 Inject the suspension of bacteria
• 1.9 Observe and record
• 2 Results and discussion
• 2.1 Pathogens infect healthy Apostichopus japonicus
• 2.2 Discussion
• 3 Conclusion
• Chapter III Isolation, purification and properties of lectins from Apostichopus japonicus
• 1 Materials and Methods
• 1.1 Materials
• 1.2 Equipments
• 1.3 Reagents
• 1.4 Determine the concentration of soluble protein
• 1.5 Determine hemagglutinating activity
• 1.6 Course of purification and identification
• 1.7 Isolation and purification
• 1.7.1 Prepare reagents
• 1.7.2 Prepare crude extract
• 1.7.3 Ammonium sulfate fractionation
• 1.7.4 DEAE-Sepharose-F.F
• 1.7.5 Sephadex G-100
• 1.8 Characterization of lectins
• 1.8.1 Prepare reagents
• 1.8.2 Determine molecular weight of subunit
• 1.8.3 Determine hemagglutinating activity
• 1.8.4 Thermal stability of lectins
• 1.8.5 Affection of pH
• 1.8.6 Affection of EDTA and divalent metal ion
• 1.8.7 Inhibition of hemagglutinating activity of lectin by sugers
• 2 Results and discussion
• 2.1 Results
• 2.1.1 Purification of lectin
• 2.1.2 Molecular weight of subunit
• 2.1.3 Hemagglutinating activity of the AJL（CK,C6,TB ）
• 2.1.4 Thermal stability of lectins
• 2.1.5 Affection of pH
• 2.1.6 Affection of EDTA and divalent metal ion
• 2.1.7 Inhibition by sugers and glycoprotein
• 2.2 Discussion about the purification
• 2.2.1 About the range of ammonium sulfate fractionation
• 2.2.2 About ion exchange chromatography
• 2.2.3 About molecular sieve chromatography
• 2.3 About the characterization of lectins
• 2.3.1 Determine molecular of the subunit
• 2.3.2 About the affection of temperature and pH
• 2.3.3 About the inhibition
• 2.4 About the Suspension of erythrocyte
• 3 Conclusion
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表学术论文