小麦白粉病抗性基因类似物的克隆和分析

论文摘要

小麦是世界上最重要的粮食作物之一。小麦白粉病是由白粉菌Blumeria graminis f. sp. tritici .（Bgt）引起的世界性真菌病害。利用小麦自身的抗性是控制白粉病最有效、经济和安全的途径。克隆植物抗病基因,通过转基因的方法增强植物抗性,是控制植物病害的新方法。为了解小麦抗白粉病的机制,本文开展了对小麦白粉病抗性基因类似物的克隆研究。Pm3b是世界上第一个被克隆的小麦白粉病抗性基因,在采用图位克隆法克隆Pm3b的过程中,发现Pm3b是成簇排列的NBS-LRR类抗病基因家族的一员。克隆Pm3b所在基因家族的其它成员,对于研究NBS-LRR类抗病基因的进化及抗病机制具有重要的意义。本研究以近等基因系Ulka/XX194/8*Chancellor（Pm2）和Chancellor为材料,利用Pm3b与其它已克隆抗病基因的保守序列设计简并引物,利用PCR为基础的同源克隆法获得11个抗病基因类似物（RGA）,并利用生物信息学软件进行了分析,同时对长片段扩增的体系进行了优化。获得的主要结果如下:1.与普通PCR相比,长片段PCR需要较高的pH值,TaKaRa公司生产的LA Taq酶所带GC buffer的pH值较低,需适当调高其pH值才可以从复杂基因组DNA中高效扩增长片段。2.培养温度对于长片段克隆的稳定传代有较大影响,长片段克隆在37℃条件下培养容易引起插入片段的全部或部分缺失,30℃条件下培养则有助于长片段克隆的稳定传代。3.共获得11个RGA,且均已在GenBank注册,登录号为EF157980—EF157990。所获得的11个RGA与Pm3位点的复等位基因有很高的相似性,其中3个是假基因,8个是蛋白质编码基因。种系分析发现,8个蛋白质编码基因组成一个单系群,它们与Pm3位点的复等位基因是并系关系。由于PCR扩增所用引物主要参考Pm3b设计,所以推测11个RGA来自于Pm3所属基因家族。4.大多数正向选择位点分布在LRR区,与其它结构域相比,LRR区承受着更大的正向选择压力。5.初步推测NBS-LRR类抗病基因的进化模式如下:当抗病基因的祖基因经复制而出现多个拷贝以后,大多数进化事件首先发生在LRR区,随后,发生在其它区的进化事件所占比例会逐渐提高;发生在LRR区的进化事件首先发生在β-折叠以外的其它结构上,其次才发生在β-折叠上。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 1.1 植物抗病的分子生物学研究
• 1.1.1 植物抗病基因
• 1.1.1.1 植物抗病基因的类型
• 1.1.1.2 植物抗病基因的结构
• 1.1.2 病原菌无毒基因
• 1.1.3 R 基因与Avr 基因互作的模式
• 1.1.3.1 受体-配体模式
• 1.1.3.2 警戒模式
• 1.1.3.3 非 R/Avr 基因互作模式
• 1.1.4 植物抗病机制
• 1.1.5 植物抗病基因克隆的方法
• 1.1.5.1 图位克隆法
• 1.1.5.2 转座子标签法
• 1.1.5.3 抗病基因同源序列法
• 1.1.5.4 差异表达基因的克隆
• 1.2 植物基因组中R 基因及其同源序列的分布和演化
• 1.2.1 植物基因组中RGA 与R 基因的关系
• 1.2.2 植物基因组中R 基因及其RGA 的分布
• 1.2.2.1 植物基因组中R 基因及其RGA 的数量
• 1.2.2.2 植物基因组中R 基因及其RGA 的存在形式
• 1.2.3 植物基因组中R 基因及其同源序列的演化
• 1.3 小麦白粉病抗性基因研究进展
• 1.3.1 小麦白粉病抗性基因的抗性遗传及其来源
• 1.3.2 小麦白粉病抗性基因的克隆
• 1.3.3 Pm3 位点抗病基因的存在形式及其意义
• 1.4 本研究的目的、意义
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.2 试验地点
• 2.3 实验试剂的配制
• 2.4 试验方法
• 2.4.1 DNA 提取
• 2.4.2 引物设计与 PCR 扩增
• 2.4.2.1 引物设计
• 2.4.2.2 PCR 反应体系
• 2.4.2.3 PCR 反应程序
• 2.4.3 PCR 产物的T-载体克隆
• 2.4.4 感受态细胞（competent cell）的制备
• 2.4.5 热激转化及蓝白筛选
• 2.4.6 阳性克隆的酶切验证
• 2.4.6.1 质粒的碱法提取
• 2.4.6.2 质粒的酶切验证
• 2.4.7 测序
• 2.4.8 生物信息学分析
• 3 结果与分析
• 3.1 全长目的片段的扩增
• 3.1.1 长片段PCR 体系的优化
• 3.1.2 PCR 反应程序的优化
• 3.2 目的片段的克隆及测序
• 3.2.1 长片段克隆培养温度的优化
• 3.2.2 测序
• 3.3 序列分析
• 3.4 种系发生树的构建及正向选择位点分析
• 3.4.1 种系发生树的构建
• 3.4.2 正向选择位点分析
• 4 讨论
• 4.1 目的片段的扩增
• 4.2 目的片段的克隆
• 4.3 11 个 RGA 的来源
• 4.4 Pm3 所属 NBS-LRR 类抗病基因的进化模式
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间形成的论文