论文摘要
膀胱癌是全球常见的泌尿系统恶性肿瘤,其中90%以上为移行上皮细胞癌。在我国泌尿系统肿瘤中,无论是发病率还是死亡率,膀胱癌均位居首位。膀胱癌的发生和发展是一个多基因、多因素参与的过程,是环境因素和遗传因素共同作用的结果。流行病学调查显示,吸烟和职业暴露是膀胱癌最常见的危险因素,但是,尽管很多人接触相同的危险因素,最终发展为膀胱癌的仅占少数,提示个体易感性存在差异。目前已知,基因遗传变异对基因的结构和功能将产生影响,进而导致基因生物学功能的改变。遗传变异是指单个核苷酸替代、插入或缺失等,其中单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphisms, SNPs）是基因遗传变异中最常见的一种类型,大约每1000个核苷酸就有一个碱基发生改变。在疾病的分子流行病学和分子遗传学研究中,单核苷酸多态性已经广泛用于基因定位的分子标记,在未知某些SNPs与特定疾病（如肿瘤）相关的情况下,可以通过比较正常人和患者携带的SNPs来定位和识别特定疾病（如肿瘤）的相关基因。细胞周期主要是由细胞周期蛋白（Cyclin）、细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）及其复合物和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子（CDKI）形成的一个级联网络控制。细胞周期的失控在肿瘤发生、发展过程中起着关键性作用。肿瘤分子生物学研究表明,几乎所有的癌基因、抑癌基因的功能效应最终都汇聚到细胞周期机制上来。细胞周期蛋白D1 （Cyclin D1, CCND1）是一种关键的细胞周期调控蛋白,是细胞周期相关性癌基因,CCND1的多态性位点很多,研究的最多的是位于外显子4上的G870A （rs603965）多态位点。CCND1蛋白是G1期增殖信号的关键蛋白,已被证实在恶性肿瘤的发生发展中发挥重要作用,且与肿瘤的发生、转移和预后密切相关。本研究通过对CCND1基因多态与中国人群膀胱癌遗传易感性的研究,进一步揭示膀胱癌发生发展的生物学机制,并通过寻找膀胱癌易感性生物标志物,为今后膀胱癌高危人群和易感人群筛查以及实施个体化预防和治疗提供重要线索。第一部分CCND1基因G870A多态与膀胱癌发病风险的病例-对照研究细胞周期的失控在肿瘤发生、发展过程中起着关键性作用。CCND1基因G870A多态指在第4外显子最后一个碱基上存在G/A单个苷酸的置换,产生野生型纯合子AA、突变型纯合子GG和杂合子AG。研究发现,CCND1基因G870A多态与多种肿瘤易感性有关,目前,仅有一篇关于CCND1基因G870A多态与中国人群膀胱癌易感性的研究报道,且样本量较小本研究采用病例-对照研究设计,以聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（Polymerase chain reaction-restriction fragment, PCR-RFLP）的技术检测402例经病理组织学确诊的新发膀胱癌患者和402例年龄（±5岁）、性别相匹配的对照,探讨了中国人群中CCND1基因G870A多态与膀胱癌风险的关系。研究结果发现,携带AA基因型的个体患膀胱癌的风险是携带GG基因型的个体的1.71倍（OR=1.71,95%CI=1.14-2.57）；携带GA/AA基因型的个体罹患膀胱癌的风险是携带GG等位基因个体的1.54倍（OR=1.54,95%CI=1.08-2.20）。进一步分层分析显示,年龄>65岁以上（OR=1.74,95%CI=1.06-2.88）、男性（OR=1.67,95%CI=1.15-2.44）和吸烟的个体（OR=1.82,95%CI=1.12-2.93）罹患膀胱癌的风险更为明显。本研究结果也显示在G1级膀胱癌和浅表性膀胱癌患者中携带AA基因型是罹患膀胱癌的危险基因。上述结果提示,CCND1基因G870A多态变异与膀胱癌遗传易感性有关,其中AA基因型可能是中国人群催患膀胱癌的危险基因型。第二部分CCND1基因G870A多态与膀胱癌易感性研究的Meta分析Meta分析是系统评价的一种统计学方法,它通过科学、系统的方法对一系列目的相同的独立研究进行综合评估的分析。基因多态性与疾病关联研究中,大样本研究与小样本研究的结果往往存在差异。Meta分析通过综合所有可以利用的同一基因同一位点与同一疾病表型的关联分析的数据,有效解决关联分析样本量不足而导致的统计效率较低的缺陷,显著提高关联分析统计的效力,并且可以发现很多单一研究本身无法解决的问题,目前在遗传疾病和基因位点之间关系的研究方面应用非常广泛。本研究通过PubMed和EMBASE数据库,检索公开发表的关于CCND1基因G870A多态与膀胱癌易感性的英文文献,截止时间为2009年3月1日。纳入研究为病例-对照研究（包括巢式病例-对照研究、以人群为基础的病例-对照研究和医院为基础的病例-对照研究）。我们通过Meta分析发现,CCND1基因G870A多态与膀胱癌易感性在不同种族中存在差异,携带A等位基因较携带G等位基因患膀胱癌的风险明显增加,且差异有统计学意义,在亚洲人群中携带AA基因型是危险因素。这与本研究结果相一致。本研究表明CCND1基因的G870A多态可以作为亚洲人群膀胱癌易感性的分子标志物。同时,我们的结果还需要今后更多的研究来进一步验证。第三部分CCND1基因G870A多态对膀胱癌预后（复发）的影响膀胱癌的分期、分级与预后密切相关。目前临床上采用的病理分级、分期方法曾为临床提供了有益的判断预后的资料,但仍很难准确预测膀胱癌的生物学行为及预后。随着分子生物学和免疫学研究的进展,对膀胱癌发生发展的分子生物学机制研究越来越深入,许多肿瘤标记物相继被发现可用于膀胱癌的预后判断,但迄今没有任何一种标记物常规应用于临床。本研究探讨了CCND1基因遗传变异与中国人群浅表性膀胱癌预后（复发）之间的关联。本研究采用前瞻性队列研究的方法,我们选择了230例浅表性膀胱癌患者并成功完成随访,所有患者均病理证实为移行上皮细胞癌。所有病人自收集之日起,按照预先设计好的联系方式和随访周期进行随访。随访时间截至2010年12月。我们采用PCR-RFLP方法对CCND1基因G870A多态进行基因分型,以性别、年龄、吸烟状态和临床分级为调整因素进一步进行多因素Cox回归分析。结果发现,CCND1基因G870A多态A等位基因可以显著增加膀胱癌的复发风险。携带GA基因的膀胱癌个体复发的风险较携带GG基因型的个体在男性中增加1.10倍（HR=2.10.95%CI=1.02-4.32,P=0.044）、年龄大于65岁的患者中增加1.46倍HR=2.46,95%CI=1.06-5.75,P=0.037)、在膀胱癌中分化（Ⅱ级）的患者中增加5.87倍（HR=6.87,95%CI=1.67-28.30,P=0.008）。本研究显示CCND1基因遗传变异与中国人群膀胱癌预后（复发）显著相关,CCND1基因G870A多态是中国人群膀胱癌预后（复发）的重要生物学标志物,可以为今后膀胱癌患者临床个体化治疗决策的制定提供理论依据,对于携带CCND1不良预后（复发）基因型的膀胱癌患者应采取个体化治疗方法,做到早发现、早治疗,以预防膀胱癌的复发,改善膀胱癌患者的预后。第四部分CCND1基因G870A多态对膀胱癌组织中CCND1mRNA和蛋白表达的影响CCND1是G1期细胞增殖信号的关键蛋白,在细胞周期蛋白中研究最深入,且与肿瘤的发生密切相关。研究发现,CCND1在多种肿瘤中高表达,并且其表达与肿瘤的增殖活性和侵袭力有密切关系,其高表达可能通过其细胞周期调节的功能启动癌基因,可作为判断肿瘤预后的一个重要指标。而目前有关CCND1基因G870A多态与膀胱癌组织中表达的研究国内外很少有报道。为进一步验证上述结果,我们拟在基因转录水平和蛋白表达水平研究CCND1基因G870A多态对膀胱癌的影响。我们运用荧光实时定量RT-PCR方法检测了16例携带CCND1多态不同基因型的膀胱癌组织,用免疫组化分析了48例膀胱癌组织病理切片,所有膀胱组织采用PCR-RFLP方法对CCND1基因G870A多态进行基因分型。荧光实时定量RT-PCR结果发现,携带AA基因型的个体CCND1 mRNA表达量比携带AG/GG基因型的个体明显增高（0.017±0.004 versus 0.007±0.002, P<0.01）；免疫组化结果发现,携带AA和AG/GG基因型者胞浆和核染色强阳性的表达量分别为71.4%和35.3%,两者相比具有统计学差异（p=0.024）。我们通过对CCND1基因G870A多态各基因型在分子转录（mRNA）水平和蛋白表达水平的研究,发现AA基因可以显著增加CCND1的表达水平,提示CCND1基因G870A多态可作为膀胱肿瘤易感性分子标志物之一。同时本研究进一步揭示膀胱癌可能的病因及发病机制,为今后更好地实施肿瘤个体化预防和治疗具有重要的理论和实践意义。