论文摘要
第一部分谷氨酰胺对肺泡Ⅱ型细胞热休克蛋白70表达的影响目的研究谷氨酰胺不同浓度以及不同作用时间对体外培养肺泡Ⅱ型上皮细胞系A549热休克蛋白（HSP）70表达的影响。方法人肺泡Ⅱ型上皮细胞系A549生长至铺满80％瓶底时更换不含胎牛血清的DMEM培养液培养过夜，使细胞处于一相对静止生长状态，然后用于下一步实验。细胞在含有不同浓度（0、2、4、8、12和16mmol／L）谷氨酰胺的DMEM培养液中培养24h，收取细胞；同一批的另一组细胞在含8mmol／L谷氨酰胺的DMEM培养液中分别培养不同时间（1、2、6、12、24和48h）后，收取细胞；以不含谷氨酰胺的DMEM培养液培养细胞24h作为空白对照（C组）；以43℃孵育1h，37℃恢复4h的细胞作为阳性对照（G组）。采用RT-PCR和Western免疫印记法分别检测HSP70 mRNA和蛋白的表达情况。结果（1）与C组相比，谷氨酰胺不同浓度各组HSP70 mRNA和蛋白表达明显增强，并具有浓度依赖性，在8mmol／L时达峰值（HSP70 mRNA：293±17.74，P＜0.01；HSP70蛋白：10.42±2.51，P＜0.01）；与G组相比，8mmol／L时HSP70 mRNA表达水平增高，差异有显著性（P＜0.01）；（2）与C组相比，8mmol／L谷氨酰胺作用1h时HSP70 mRNA和蛋白表达即开始增高，在24h处达峰值，48h仍维持较高水平（HSP70 mRNA：191±17.45，P＜0.01；HSP70蛋白：7.33±1.67，P＜0.01）。结论谷氨酰胺可明显上调体外培养肺泡Ⅱ型细胞系A549 HSP70 mRNA和蛋白的表达，并具有浓度和时间依赖性。第二部分谷氨酰胺预处理对过氧化氢诱导肺泡Ⅱ型细胞凋亡的影响目的研究8mmol／L谷氨酰胺预处理12h对过氧化氢诱导的肺泡Ⅱ型细胞系A549 HSP70蛋白表达和细胞凋亡的影响。方法人肺泡Ⅱ型细胞系A549生长至铺满80％瓶底时，在不含胎牛血清的DMEM培养液中培养过夜，使细胞处于一相对静止生长状态，然后细胞分为四组：（1）空白组（C组）：以不含谷氨酰胺的DMEM培养液培养细胞12h后，与过氧化氢同体积生理盐水加入培养液继续培养5h，收取细胞；（2）单纯谷氨酰胺组（Gln组）：以含谷氨酰胺8mmol／L的DMEM培养液培养细胞12h后，与过氧化氢同体积生理盐水加入培养液继续培养5h，收取细胞；（3）单纯过氧化氢刺激组（H2O2组）：以不含谷氨酰胺的DMEM培养液培养细胞12h后，培养液中加入终浓度为400μmol／L过氧化氢刺激5h，收取细胞；（4）谷氨酰胺预处理后过氧化氢刺激组（Gln+H2O2组）：以含谷氨酰胺8mmol／L的DMEM培养液培养细胞12h后，过氧化氢400μmol／L刺激5h，收取细胞。采用Western免疫印记法检测HSP70的表达情况，流式细胞仪膜联蛋白V（Annexin-V）法检测细胞凋亡情况。结果与C组（1.87±0.55）相比，Gln组（8.42±1.38）、H2O2组（9.35±1.57）和Gln+H2O2组（13.12±1.85）细胞HSP70表达分别增高约4.5倍、5倍和7倍，差异有显著性（P＜0.01）；与H2O2组相比，Gln+H2O2组表达进一步增高，差异有显著性（P＜0.01）。与C组相比，Gln组细胞总凋亡率无明显变化（P＞0.05）；H2O2组和Gln+H2O2组细胞总凋亡率明显增高，分别为7.48±0.53％和6.06±0.39％，约为C组的1.6倍和1.3倍（P＜0.01）；与H2O2组相比，Gln+H2O2组细胞总凋亡率降低（P＜0.01）。结论谷氨酰胺8mmol／L预处理12h对过氧化氢诱导的A549细胞凋亡有明显抑制作用，并且明显上调此时A549细胞HSP70的表达。